项目文章 | 恭喜上海交大刘伟课题组运用DIA蛋白组技术探究机械刺激介导肌腱发育机制发文工程技术一区顶刊

2022-07-18 07:40:26, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

前言

肌腱是一种基于胶原蛋白的结缔组织，它连接骨骼和肌肉，将肌肉收缩力传递给骨骼组织，以施加受控的肢体运动。对于这种功能，肌腱胶原纤维以波浪形和平行模式排列，具有独特的双极型胶原原纤维上层结构，其中包含细纤维和粗纤维。这种特殊的组织结构有助于肌腱的高机械强度，使它们能够承受力并进行肢体运动。先前的研究表明，肌腱细胞对体外的机械应变敏感，并因此能够上调基质产生和基质重塑分子的表达，从而表明机械刺激可能是肌腱发育和再生的重要生态环境。

2022年6月，上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科刘伟课题组在Acta Biomaterialia期刊发表了题为 “Synergistic effects of mechanical stimulation and crimped topography to stimulate natural collagen development for tendon engineering”的研究成果，通过DIA定量蛋白质组学研究方法，发现了切断的肌腱中呈现出与胶原蛋白组装过程相关的差异表达的关键调节分子。此外，使用生物信息学分析还揭示了机械刺激介导的时空胶原组装的复杂调控网络，揭示了机械负荷干预下的大鼠跟腱的发育，以确定机械刺激介导的肌腱发育的机制，奠定了未来应用于功能性肌腱工程的理论基础。文中特别致谢欧易生物总监祖启东，为该项目提供数据分析服务。

基本信息

中文标题：机械刺激和波浪形结构的协同效应刺激肌腱工程的天然胶原蛋白发育

研究对象：大鼠

发表期刊：Acta Biomaterialia

影响因子：10.633

发表时间：2022 年6月

合作单位 : 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科

运用生物技术：DIA定量蛋白质组学（由欧易/鹿明生物提供技术支持）

研究背景

尽管机械刺激在肌腱工程中的重要性已在细胞功能和支架降解方面得到充分报道，关于其在形成特定肌腱基质结构中的意义的基础研究仍然大大不足。波浪形结构也是一个重要的生态环境，可能对机械刺激产生协同效应。

因此，我们假设单侧机械刺激在肌腱生态环境中的适当肌腱发育中起重要作用。这很可能通过使用机械信号来专门修改有助于胶原蛋白组装、成熟和双极原纤维上层结构形成的关键调节分子的表达来实现。本研究旨在通过测试机械负荷和拟腱支架对胶原蛋白产生和组装的协同作用来证明这一假设，从而为功能性肌腱工程提供有价值的见解。

研究思路

实验设计

研究结果

1.剥夺机械刺激导致病理性肌腱发育

SD大鼠肌腱通过手术切片去除机械刺激，术后80天观察肌腱发育情况。在 80 天的发育期间，在没有机械刺激的情况下，在肌腱组织中观察到杂乱无章和不成熟的胶原结构。如图 2A 所示的大体视图所示，这些发现表明，剥夺机械刺激会阻碍肌腱发育。

图1 |剥夺机械刺激会干扰体内正常的肌腱发育

a)切断肌腱和自然肌腱的大体视图、组织学和组织化学比较（仅夹伤对照肌腱）。在大体上，左侧（红色箭头）代表切断的肌腱，右侧（黑色箭头）代表正常发育的肌腱（或控制肌腱）。在组织学中，所有图像代表纵向组织切片，显示天狼星红染色的图像是偏光显微镜下确定胶原类型的实际图像（黄色代表 I 型，绿色代表 III 型）。放大倍数，100 倍，Bar = 200 μm；

b)对切断和自然肌腱的组织学评分，以及纤维结构 (FS)、纤维排列 (FA)、细胞核 (RN)、血管分布 (VC) 和细胞密度 (DC) 的参数进行半定量评估( n = 3)。*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

2.机械刺激对于原纤维双极结构的形成至关重要

天然肌腱中的胶原原纤维结构具有双极结构的特征，其中大小尺寸的胶原原纤维以有组织的方式整合和分布。如图3A所示，在 D 10 时，两组均观察到大小均匀的胶原原纤维，尽管在剥夺机械刺激后原纤维厚度降低。然而，在 D 20 时，双极结构仅出现在自然肌腱中，并在之后的发育过程中变得显著。相比之下，在整个过程中，均一大小的胶原原纤维图案仍保留在切断的肌腱中。

然而，胶原原纤维的直径随时间显著增加。一般来说，与天然肌腱相比，在所有时间点，切断肌腱中的胶原原纤维直径明显更小。在发育过程中，切断肌腱的力学性能均明显低于天然肌腱。此外，对于每一组，两个样品的力学性能都呈现出随时间增加的趋势, 如图3B C。该结果表明，在肌腱中形成原纤维双极结构需要机械刺激。

图2 | 剥夺机械刺激会干扰胶原原纤维结构的发育并降低切断肌腱的机械性能

a)TEM 显示天然肌腱胶原蛋白随着胶原原纤维直径的逐渐增加和原纤维双极结构的出现从第 20 天开始发育。机械刺激的丧失导致到发育不良的胶原原纤维，其特征是均匀大小和低直径的原纤维。放大倍数，100,000×；条形 = 50 纳米；

b)两个肌腱组的胶原原纤维直径的定量分析；

c)两个肌腱组力学性能的定量分析。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

3.关键调节分子在肌腱发育过程中介导力学刺激的胶原蛋白重塑

在第 10 天和第 20 天收获切断的肌腱和天然肌腱，然后运用上海鹿明生物科技有限公司的（data independent acquisition）DIA定量蛋白组学技术平台筛选确定了差异表达蛋白（DEP）。

如图4A所示，对DEP的功能富集分析（天然肌腱与切断肌腱的比率）进行分析并分类为生物过程(BP)、细胞成分 (CC) 和分子功能 (MF) 用于GO分析。就 BP 而言，上调的 DEP 主要与胶原原纤维组织、细胞对机械刺激的反应。对于 CC，上调的 DEP 主要位于 D 10 和 D 20 的细胞外基质、胶原三聚体和含有胶原的细胞外基质。特别是，细胞核在 D 10 时表达最高的 CC，而线粒体是D 20 时最高的 CC , 表明核信号和线粒体代谢可能参与力学刺激的肌腱发育。根据 MF 分析，上调的DEP在D 10时主要富集胶原结合、整合素结合和细胞外基质结构成分，在D 20 时主要富集金属离子结合和细胞外基质结构成分。总的来说，结果表明上调的蛋白质主要参与胶原蛋白分泌和胶原蛋白重塑，这可能受整合素和细胞核介导的细胞内信号传导的调节。

为了进一步定义关键的 DEP，生成了与胶原蛋白组装相关的这些 DEP 的热图，如图 4 B 所示。证明胶原蛋白 I、II 和 III 是肌腱胶原蛋白成分中存在的主要分子。COMP、Lox、Kera 、Fmod 和Lum是作为胶原交联分子的主要分子。为了进一步阐明调控网络功能，将整个胶原组装相关分子纳入构建共表达网络（图4C)，在 D 10 和 D 20 的 DEP 中存在五种差异表达的分子，即Fmod、Lum、Col5a1、Kera 和 Fgf-1（图 4D)，从而表明这些分子在介导胶原组装和成熟中的重要性。

此外，免疫组织化学用于进一步确认两组肌腱中差异表达的关键调节分子。如图5A所示。从而证实了蛋白质组学分析的结果。

图3 | 质谱和生物信息学分析

a)GO分析在第 10 天和第 20 天切断和天然肌腱之间的差异表达蛋白 (DEP)，包括生物过程(BP)、细胞成分 (CC) 和分子功能 (MF)。BP、CC 和 MF 分别用绿色、蓝色和红色标记；

b)选定 DEP 的聚类分析。红色表示高表达的蛋白质，蓝色表示弱表达的蛋白质。每组包含来自三个独立样本的数据；

c)在与胶原蛋白组装相关的 DEP 上构建共表达网络（左为 D 10，右对于 D 20)。红色代表表达增加，绿色代表表达减少。圆圈和三角形代表共表达分析中的度数；

d)D 10 和 D 20 时间点共有DEP。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

图4 | 不同时间点 DEP 的免疫组织化学

a)纤维调节蛋白 (Fmod)、 lumican (Lum)、胶原蛋白 5a1 (Col5a1)、角质层(Kera) 和酸性成纤维细胞生长因子(Fgf-1)的免疫组织化学染色图像。放大倍数，200×，Bar = 100 μm；

b)免疫组化染色的半定量分析 ( n = 3)。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

4、肌腱模拟二维底物增强机械刺激下的肌腱基因表达

肌腱的特点是胶原纤维呈波浪状平行排列。因此，波浪形的PDMS膜被制造为 2D 模型（图 6A）。如图 6B 所示，在细胞接种后第 2 天，在波浪形微槽表面上，肌腱细胞呈现出波浪状且平行的排列（右），类似于天然肌腱的排列。相比之下，当播种在线性微槽地形表面（左）。为了研究这种波浪形地形的作用，将肌腱细胞接种在两个基板上，并进行 5 天的机械刺激；结果表明，机械刺激下的波状形貌可以显著上调肌腱标志物的表达（图6 C)。此外，为了研究机械刺激的作用，在有或没有机械拉伸的波浪状基板上执行相同的程序。结果表明，机械刺激显著上调了Fmod、Lox、Dcn、Bgn、Kera、Tnmd、Scx、Col1、Col3、Col6、Fgf - 1、 Fgf - 2和HDAC4的表达（图6D）。这些发现与蛋白质组学发现一致，并表明机械刺激和波浪/波浪形貌在肌腱工程中胶原组装和成熟的重要作用。

图5 | 具有波浪形微槽形貌表面的PDMS膜的制备及其在体外机械拉伸下对诱导肌腱表型和胶原蛋白组装过程的影响

a)制造波浪形 PDMS 膜的策略示意图；

b)接种后第 2 天，在机械拉伸下，PDMS 上的细胞接种示意图和线性和波浪形微槽表面肌动蛋白细胞骨架的免疫荧光图像；

c)机械拉伸下线性和波浪形表面培养的肌腱细胞的基因表达谱 ( n = 3)；

d)在没有或有机械拉伸的情况下在波浪表面上培养的肌腱细胞的基因表达谱 ( n = 3)。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

5、残余应力的释放导致 3D 波浪 PLLA-PHBV 支架的形成

通过释放存在于纤维内的残余应力形成波浪状结构（图7A）。如 SEM 图像（图 7 B）所示，在高速旋转的滚筒上收集纤维有效地产生排列整齐的 PLLA-PHBV 纤维（图 7 C）。在 100% 应变固定形状恢复过程后，处理后的 PLLA-PHBV 纤维长度收缩，并沿纤维骨架呈现波浪状波浪图案，类似于天然肌腱组织中存在的胶原纤维结构。

为了检查纤维中分子取向的变化，如图 7 E 所示。当入射红外 (IR) 辐射的电矢量与特定键振动的跃迁矩矢量一致时，特征峰波浪纤维，显示出比电纺纤维更高的强度。这表明在波浪纤维中形成了更高的分子取向。纤维的波浪结构也与机械性能密切相关。在波浪的纤维中观察到一个明显的非线性脚趾区域，如图7 G所示，观察到波浪纤维的趾部区域（即过渡应变）以约 100 应变结束相比之下，直的电纺纤维仅显示以 0.1% 的应变结束的脚趾区域（图 7 H）。此外，与直的电纺纤维相比，波浪纤维具有更高的极限应力和更低的杨氏模量 (图 7 K）。波浪纤维显著更高的极限应力与结晶度的增加和分子链取向度的增加一致，这是由于它们的正相关（图 7 L）。

图6 | 具有波浪结构的对齐 PLLA-PHBV 纳米纤维的制备和表征

a)具有波浪结构的纳米纤维的制备示意图；

b)初生纳米纤维和波浪纳米纤维的 SEM 形态；

c)纤维直径比较 ( n = 3);

d)波浪比较 ( n = 3)；

e)波浪纳米纤维的 pFTIR 分析；

f)波浪纳米纤维的 XRD 分析；

g)两根纳米纤维的应力-应变曲线（左）和左图绿色虚线部分的放大图（右）；

h)初纺和波浪纳米纤维的力学分析（n = 3）；

i)初纺和波浪纳米纤维的力学分析（n = 3）；

j)初纺和波浪纳米纤维的力学分析（n = 3）；

k)初纺和波浪纳米纤维的力学分析（n = 3）

l)分子取向示意图波浪状结构形成过程中的变化。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

6、3D 模拟支架上的机械拉伸通过增强的胶原蛋白组装过程促进肌腱细胞表型

如图8A所示，将肌腱细胞接种在波浪对齐的PLLA-PHBV纤维上，以检查机械拉伸和波浪对齐的形貌对胶原蛋白组装和肌腱分化的协同作用。为了测试拉伸细胞的活力，首先将细胞拉伸 7 天，然后在不拉伸的情况下收获 7 天用于 CCK8 测定。结果显示出相似的增殖水平；然而，在 D 3 和 D 7 观察到相对较高的拉伸细胞率，在 D 5 观察到相对较高的静态细胞率（图 8 B）。在有或没有拉伸的情况下培养 4 天后，活/死细胞双染色也表现出相似的活/死细胞比率（图 8C）。

F-肌动蛋白染色表明，在机械拉伸组中观察到更多平行排列的细长单细胞，这是肌腱中天然肌腱细胞的一个关键特征，而不是在静态细胞中观察到聚集和适度无序的细胞模式（图8 D)。此外，动态拉伸可以迫使肌腱细胞呈现出适度拉长的细胞形状，具有相当高的细胞纵横比（图 8 F），这有利于之前报道的肌腱分化。此外，与静态细胞相比，机械拉伸还显著增强了基质的产生（图 8 E），这得到了胶原分泌定量数据（图 8 G）的支持。

特别是，当将肌腱细胞接种在具有波浪和平行电纺纤维的这种肌腱模拟支架上时，机械刺激可以显著增强肌腱标记物的基因表达（图 8 I）。它还增强了Fgf-1 和 Fgf-2的基因表达（图 8 J）。特别是，当提供单侧机械刺激时，在这种特殊支架上，在肌腱发育过程中在胶原组装和成熟中起重要作用的关键正调节分子的表达也显著增强（图 8 H）。各种类型的 HDAC，包括HDAC3还观察到 HDAC4 的表达上调（图8K），表明该调节的 HDAC 亚型特异性。

图7 | 波浪结构和机械拉伸在波浪 3D PLLA-PHBV 纳米纤维中诱导肌腱表型和胶原蛋白组装的协同作用

a)在生物反应器内机械拉伸的波浪支架上的细胞接种示意图；

b)机械刺激 7 天后肌腱细胞活力的 CCK-8 分析 ( n = 3)；

c)接种后 D 4 时静态和拉伸细胞的活/死测定；

d)接种后 D 4 静态和拉伸细胞中 F-肌动蛋白的荧光图像；

e)接种后 D 7 的细胞接种波浪纳米纤维的 SEM 图像；

f)F-肌动蛋白图像中静态和拉伸细胞的细胞纵横比分析 ( n = 3);

g)在接种后 D 3 ( n = 3)对静态和拉伸细胞的胶原蛋白生产进行量化；

h)-k)接种在波浪纳米纤维上的肌腱细胞的基因表达谱，没有和有机械拉伸 3 天（n = 3）。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

7、HDAC4 和 PI3K 通路在力学介导的胶原蛋白组装中的作用

为了揭示力学介导的胶原蛋白组装的潜在机制，DEP 的数据用于使用 DAVID 在线工具进行 KEGG 通路分析。如图 9A 所示，排名靠前的途径是ECM-受体相互作用和 PI3K-Akt信号通路，与先前报道的机械途径一致。在对 DEP 进行PPI 网络分析后，观察到HDAC4 也被观察到是匹配的 PPI 网络中的关键分子之一，表明在该事件中存在 HDAC4 介导的核信号。蛋白质组学分析进一步表明，HDAC4 在切断的肌腱中几乎检测不到，而在天然肌腱中检测到它的产生，并且在 D 20 的表达量比在 D 10 的表达量高近 10 倍（图 9 C），表明其在正常肌腱发育中的重要作用。

最后，为了验证 HDAC4 介导的核信号和 PI3K-Akt 通路在胶原组装中的作用，分别使用 LMK-235（HDAC 抑制剂）和 LY-294002（PI3K 抑制剂）（图9D）。如图9E所示，在机械刺激下，LMK-235处理显著抑制Fmod、Tnmd和Col1的基因表达，但不抑制Scx和Lum的基因表达。LY-294002 的治疗可以显著抑制Fmod、Lox、Scx和Col1的基因表达（图 9F）。因此，这些结果证明了 HDAC4 介导的核信号和 PI3K-Akt 通路在机械刺激介导的胶原蛋白组装中的关键作用。

因此，我们提出了该事件的潜在机制，如图 9 G 所示，其中机械信号可能通过 ECM-整合素-PI3K 途径从细胞外空间传递到细胞内部分，也可能通过细胞骨架变形，这进一步导致核变形和 HDAC4 介导途径的激活。两种途径都介导相关分子的基因表达，这些分子进一步翻译并参与胶原蛋白的组装。

图9 | 使用生物信息学分析、信号通路验证和提出的假设探索机制

a)DEP 的数据用于使用 DAVID 在线工具进行 KEGG 通路分析

b)与胶原蛋白组装相关的 DEP 的PPI 网络分析；

c)质谱显示HDAC4在 D 10 和 D 20 时在机械负荷肌腱（自然肌腱）中高度表达；

d)生物反应器内相关通路抑制剂的信号通路验证示意图;

e)HDAC4 和 PI3K 通路抑制剂 (LMK-235 和 LY-294002)在波浪形微槽表面的体外n = 3)

f)HDAC4 和 PI3K 通路抑制剂 (LMK-235 和 LY-294002)在波浪形微槽表面的体外n = 3)；

g)主要通过 HDAC4 和 PI3K 途径提出的机械刺激介导的胶原组装和成熟的机制。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

相关讨论

从自体/异体肌腱移植到肌腱再生，肌腱修复成为趋势，其中工程肌腱将发挥重要作用。先前的研究表明，在兔子、大鼠、猪和母鸡的模型中，使用工程肌腱支架可以再生修复肌腱缺损。其中机械刺激是证明是必不可少的。然而，这些工程肌腱通常无法形成双极上层结构天然肌腱胶原纤维（粗纤维和细纤维交织），这可能会干扰天然肌腱的最大机械强度。因此，我们采用逆向工程策略，通过剥夺产后大鼠发育中跟腱的机械刺激来剖析力学介导的胶原蛋白组装过程的机制。此外，仿生支架被认为是模拟组织再生生态位环境的关键，因此也被认为是一种潜在的翻译尝试。

众所周知，胶原蛋白组装是一个复杂的过程，涉及多个分子，以确保组装的胶原原纤维及时成熟和重塑，并实现机械功能。一般而言，肌腱胶原原纤维生成会导致成熟胶原原纤维组装成线性和横向原纤维生长。未成熟的原纤维中间体端对端组装形成较长的原纤维，与成熟的和具有机械功能的原纤维一致。在胶原组装/成熟的时空调节过程中，许多相关分子（除了已检查的 5 个分子）可能参与了该过程，并具有及时调节的表达。COMP、Fbln5、Itga2、Lox、Bgn、Fn1、Jak1、Tnc 和MMP14是在不同阶段参与该过程的所有分子；这些结果也与共表达分析结果非常吻合（图4）。需要进一步阐明这些分子在胶原原纤维生长中的作用，特别是在双极结构形成中的作用。

仿生支架被认为是一个重要的生态环境，机械刺激和仿生地形结构之间的协同效应也得到了很好的报道。肌腱细胞通常被拉长并平行排列在肌腱组织中，我们之前的报告表明，当人类成纤维细胞被接种到线性微槽地形表面时，它们很可能转分化为肌腱细胞. 如前所述，与人类真皮成纤维细胞不同，由于未知原因，在该线性地形表面中拉长和平行排列大鼠肌腱细胞具有挑战性。值得注意的是，机械负荷和拟肌腱支架之间的协同效应也成功地证明了诱导胶原蛋白组装和肌腱表型，从而为功能性肌腱工程提供有价值的指导和见解。

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本研究使用上海鹿明生物科技有限公司的DIA定量蛋白组学技术平台确定和验证机械剥夺模型中调节的关键的分子和通路途径，用于揭示力学介导的肌腱胶原蛋白发育过程。进一步的生物信息学分析和体外测定表明，整合素和细胞骨架介导的途径，如 PI3K-Akt 信号传导和 HDAC4 介导的核信号传导，起着核心作用。

此外，波浪形微槽表面和波浪纳米纤维支架被证明是有效的肌腱因子，可以在机械刺激下激活胶原蛋白组装过程。为了实现天然双极胶原原纤维结构和天然肌腱的最大机械强度，这种特殊的地形支架很可能作为仿生生态环境，本研究中开发的策略多模型进一步验证后有望实现临床转化。

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