一作精读 | 南京林业大学喻方圆团队探究东京野茉莉种子脂肪酸生物合成机制

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2021年4月，南京林业大学喻方圆教授（一作：吴岐奎）课题组在Journal of the Science of Food and Agriculture期刊发表了题为“Proteomic analysis of metabolic mechanisms associated with fatty acid biosynthesis during Styrax tonkinensis kernel development”的研究成果，通过转录组学+iTRAQ标记定量蛋白组学研究方法，分析东京野茉莉种子发育过程中脂肪酸生物合成相关基因的表达趋势，确定油脂积累的主要影响因子并构建其调控网络。为野茉莉属植物种子油用研究和后续功能分析研究提供了一定的研究基础。

东京野茉莉，自然分布于东南亚和我国华南地区，是具有发展潜力的经济树种。成熟期种子油脂含量高达60%；脂肪酸组分合理，其中油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）占比可达87%左右；各燃料特性指标符合中国、欧盟、美国等不同国家或地区的相关标准，可以直接或经简单改良后用于生物柴油的制备。

课题组前期以不同发育阶段的东京野茉莉种子为研究对象，分析其发育过程中油脂含量、脂肪酸组分及燃料特性等指标的动态变化，确定种子发育的四个阶段：

种子发育初期（花后60天之前；含油率缓慢增加，脂肪酸组分变化明显）；

种子发育活跃期（花后60天到80天；含油率迅速增加，脂肪酸组分持续变化）；

种子发育后期（花后80天到120天；含油率存在相对下降，多元不饱和脂肪酸含量较高）；

种子成熟期（花后120天到150天；含油率再次增加，脂肪酸组分趋于稳定）。

本研究在转录组学分析的基础上进行蛋白质组学测定，在蛋白层面上分析脂肪酸生物合成的相关因子，确定油脂积累的调控模型。

1. 差异表达蛋白鉴定

根据蛋白在发育过程中不同时间点的丰度变化，对所有的差异蛋白进行Mfuzz软聚类分析，1,472个差异蛋白被分到9类（图1）。通过KEGG代谢通路富集分析，与脂肪酸合成相关的差异表达蛋白富集分析主要集中在IV类，同时转录组学中相关的差异表达基因富集分析主要集中在D、F类（Wu et al., 2020），二者均为在花后70天存在表达峰值。

图1 | 东京野茉莉蛋白质组中差异蛋白的Mfuzz聚类分析

2.与脂肪酸合成相关的蛋白分析

通过搜库，识别出42条与碳水化合物分解及脂肪酸合成相关的蛋白进行分析（图2），包含4个淀粉和蔗糖代谢相关蛋白，12个糖酵解/糖异生相关蛋白，3个磷酸戊糖途径相关蛋白，6个三羧酸循环相关蛋白、13个脂肪酸合成相关蛋白、3个脂肪酸代谢相关蛋白及1个油体膜蛋白相关蛋白。

图2 | 碳水化合物代谢及脂肪酸合成相关蛋白的鉴定分析

3. 关键基因的qRT-PCR分析

结合组学分析结果，筛选17个与油脂积累相关的酶基因进行qRT-PCR分析（图3）。其中，与脂肪酸合成相关的基因，相对表达值在花后70天表现为峰值。与脂肪酸去饱和相关的基因，硬脂酸-ACP去饱和酶2（sad2）表达与脂肪酸合成相关基因一致，在花后70天存在峰值；脂肪酸去饱和酶2（fad2）存在不同的表达趋势，其表达水平在花后四个阶段呈现下降的趋势。与三酰甘油合成相关的基因，相对表达趋势具有多样化，大多数在花后100或130天存在较高水平的表达。与油体合成相关的基因，油体蛋白1，呈现为持续性显著上升的表达趋势。

图3 | 油脂积累相关酶基因时序表达的qRT-PCR分析

综合转录组及蛋白质组分析结果中与油脂积累相关的主要作用因子，构建东京野茉莉种子发育过程中油脂积累的调控网络。根据KEGG代谢通路富集分析，碳代谢、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢、脂肪酸合成、脂肪酸去饱和、脂肪酸代谢及甘油酯代谢是油脂积累过程中主要涉及到的代谢通路。通过调控网络分析，丙酮酸脱氢酶和乙酰CoA羧化酶处于网络的中心位置，是碳水化合物分解与脂肪酸生物合成两部分关联的主要节点，在脂肪酸生物合成及油脂积累网络中起到了重要的中心调控作用，即丙酮酸的提供和脂肪酸合成是油脂积累的主要因素。

在本研究中，利用iTRAQ标记定量蛋白组学方法对东京野茉莉种子发育的4个时间点采样进行蛋白质组学分析。获得了2338个蛋白和1473个DEPs。Mfuzz聚类分析显示，在种子发育过程中，转录本和蛋白质组之间存在相当大的时序一致性。在四个发育时期中，花后70天（种子发育活跃期）是视为东京野茉莉种仁发育的关键时期：在该阶段与脂肪酸生物合成相关的功能基因和酶蛋白均达到表达峰值，同时种仁内部大部分营养物质开始迅速积累。通过转录组数据和蛋白质组数据综合分析油脂合成的调控网络，乙酰CoA羧化酶和丙酮酸脱氢酶两个酶体系处于中心位置，在脂肪酸的合成过程中具有主导作用。

东京野茉莉是野茉莉属中的典型树种，目前该种植物在野茉莉属中的研究较全面。本篇在前期转录组学研究的基础上，通过蛋白质组学手段从蛋白质水平上筛选种子发育过程中脂肪酸生物合成的关键因子，确定乙酰CoA羧化酶和丙酮酸脱氢酶在种子油脂积累过程中的重要性，构建东京野茉莉种子发育过程中油脂积累的调节机制，为野茉莉属植物以及木本油料植物的进一步探究提供一定的研究基础。

参考文献：

1.ZHANG Z, WANG X, LUO Y, YU FY. Carbon competition between fatty acids and starch during benzoin seeds maturation slows oil accumulation speed [J]. Trees-Structure and Function, 2017, 31: 1025-1039.

2.ZHANG Z, LUO Y, WANG X, YU FY. Quantitative spatiotemporal oil body ultrastructure helps to verify the distinct lipid deposition patterns in benzoin endosperm and embryo cells [J]. Forests, 2018, 9: 265.

3.WU QK, ZHANG ZH, PENG H, WU YL, YU FY. The nutrient distribution in the continuum of the pericarp, seed coat, and kernel during Styrax tonkinensis fruit development [J]. PeerJ, 2019, 7: e7996.

4.WU QK, CAO YY, CHEN C, GAO ZZ, YU FY, GUY RD. Transcriptome analysis of metabolic pathways associated with oil accumulation in developing seed kernels of Styrax tonkinensis, a woody biodiesel species [J]. BMC plant biology, 2020, 20: 121.

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Ken 撰文

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