Hortic Res | 山东农业大学运用蛋白质谱鉴定及酵母文库等探究苹果叶片衰老发生的调控模型

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2021年7月山东农业大学作物生物学国家重点实验室由春香教授课题组在Horticulture Research期刊发表了题为“The apple C2H2-type zinc finger transcription factor MdZAT10 positively regulates JA-induced leaf senescence by interacting with MdBT2”的研究成果，通过蛋白质谱鉴定和遗传转化等技术研究方法，发现C2H2类锌指转录因子MdZAT10正向调控茉莉酸诱发的叶片衰老模式特征，探究了与茉莉酸响应蛋白MdBT2相互作用以延迟叶片衰老的机理，描绘了苹果叶片衰老发生过程的调控信号通路。为高产优质多抗的苹果品种的分子育种提供了理论依据。

我国是目前较大的苹果（Malus domestica）生产和消费国家，种植面积和产量均居前列，苹果市场在推进国民经济发展过程中发挥着举足轻重的作用。然而，伴随着一系列生理生化变化，叶片的衰老严重制约着光合作用的效率，降低了作物的产量和品质。因此，对延缓叶片的衰老进程研究可提供潜在的经济效益。本文为探究苹果叶片衰老的潜在分子机制，作者借助蛋白质谱鉴定、植物遗传转化、蛋白免疫印迹、酵母双杂、Pull-down、双分子荧光互补等实验计划，对C2H2类锌指转录因子MdZAT10与其互作蛋白MdBT2在茉莉酸诱发下的叶片衰老过程进行研究。不仅揭示了关键转录因子介导特定生物学发生的调控极值，而且为苹果的遗传改良提供了科学依据。

1.MdZAT10正向调控叶片衰老

MdZAT10在早期衰老（Early-senescent）和晚期衰老（Late-senescent）叶片中的表达量远高于非衰老（Nonsenescent）叶片中的表达量（图1-a），且过表达拟南芥植株幼苗比野生型拟南芥显示更多的发黄叶片（图1-b）。而且，这些转基因叶片上的叶绿素含量和最大光合作用量也与叶片上颜色的变化相一致（图1-c和图1-d）。过表达MdZAT10苹果叶片显示出早期衰老的现象，而反义表达的MdZAT10苹果叶片则表现出延迟衰老的迹象（图1-e）。

图1 | MdZAT10促进叶片衰老

2.MdZAT10与MdANBI5的相互作用

借助蛋白质谱鉴别MdZAT10的互作蛋白，同时利用酵母双杂实验来验证MdANBI5（图2-a）。随后，作者开展Pull-down实验发现，MdABI5-His能够被M的ZAT10-GST融合蛋白下调（图2-d），且双分子荧光互补实验也在本氏烟草叶片上鉴别到较强的黄色荧光蛋白信号，这些结果说明了MdZAT10与MdANBI5的相互作用。

图2 | MdZAT10与MdABI5的相互作用

3.MdZAT10促进MdABI5介导的叶片衰老

以过表达MdZAT10的和过表达MdABI5的拟南芥转基因植株为双亲进行杂交，子代幼苗表现出更明显的叶片衰老现象（图3-a），且叶片中的叶绿素含量也相对最低（图3-b）。与之一致的结果也出现在过表达的苹果叶片中（图3-c和图3-d），这些结果也说明了MdZAT10促进MdABI5介导的叶片衰老。

图3 | MdZAT10促进MdABI5介导的叶片衰老

4.MdBT2与MdZAT10的相互作用

酵母双杂交实验证实了除了MdABI5之外，MdZAT10与茉莉酸响应蛋白MdBT2也存在互作关系（图4-a和图4-b）。随后，作者开展了蛋白免疫印迹实验和双分子荧光互补实验（图4-c和图4-d），这些结果也都说明了MdZAT10通过与MdBT2的相互作用调控茉莉酸诱导的叶片衰老过程。

图4 | MdZAT10与MdBT2的相互作用

综上所述，本研究借助蛋白质谱鉴定、酵母文库、植物遗传转化等实验技术对苹果叶片的衰老过程进行探究，发现MdZAT10通过与MdABI5的相互作用正调控叶片衰老，增强MdABI5对叶绿素降解基因MdNYC1和MdNYE1的转录活性。另外，在没有MeJA的情况下，MdBT2与MdZAT10相互作用并泛素化MdZAT10降解MdZAT10，从而负调控MdZAT10促进叶片衰老。而MdZAT10是由外源的MeJA诱导的，促进了叶片衰老。MeJA加速了MdBT2的降解，释放MdZAT10，参与茉莉酸诱导的叶片衰老。在本研究中，作者通过与MdBT2和MdABI5的直接相互作用，确定了MdZAT10在叶片衰老调控网络中的作用。

图5 | MdZAT10在苹果叶片衰老过程中的调控模型

借助蛋白质谱鉴定、植物遗传转化、蛋白免疫印迹、酵母双杂、Pull-down、双分子荧光互补等实验计划，对C2H2类锌指转录因子MdZAT10与其互作蛋白MdBT2在茉莉酸诱发的叶片衰老过程进行了研究。不仅揭示了关键转录因子介导特定生物学发生的调控极值，而且为苹果的遗传改良提供了科学依据。

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小林 撰文

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