Journal of Proteomics | “植”入活力！上海交大敬璞课题组探究花青素的抗衰老机制

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● 前言

2021年02月上海交通大学敬璞教授课题组在Journal of Proteomics期刊发表了题为“TMT-based quantitative proteomic analysis of hepatic tissue reveals the effects of dietary cyanidin-3-diglucoside-5-glucoside-rich extract on alleviating D-galactose-induced aging in mice”的研究成果，通过TMT标记定量蛋白组学方法，发现了Cyanidin-3-diglucoside-5-glucoside (CY3D5G) 衍生物有助于减少 ROS 的产生和释放，并减轻D-半乳糖诱导的老年小鼠的氧化损伤。其研究成果可以促进花青素在食品和制药行业的使用。

中文标题：基于 TMT 的肝组织定量蛋白质组学揭示了富含花青素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的膳食提取物对减轻 D-半乳糖诱导的小鼠衰老的影响

研究对象：小鼠

发表期刊：Journal of Proteomics

影响因子：4.044

发表时间：2021年2月10日

发表单位：上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业（南方）重点实验室

运用生物技术：TMT标记定量蛋白组学

● 研究背景

衰老是一种复杂且不可避免的生物现象，衰老的自由基理论提示活性氧（ROS）的积累可能导致细胞和组织的氧化损伤，抗氧化酶被认为是对抗氧化损伤的主要生物防御。肝脏中发生超过 10,000 种生化反应，如糖异生、氧化磷酸化和脂肪分解，深入了解肝脏蛋白质组将提供对分子变化的全面了解。

饮食对生理健康有着显著的影响，大量摄入的水果和蔬菜已被证明可以降低与衰老相关的损伤风险，红甘蓝花青素已被证明具有许多健康益处，包括预防重金属毒性、减少心脏和肝脏抗氧化剂以及抑制血浆蛋白和脂质中的氧化应激。红甘蓝中的主要花青素是花青素 3-diglucoside-5-glucoside（CY3D5G），之前的研究表明，富含 CY3D5G 的提取物表现出体外抗氧化作用；然而，体内抗衰老作用和任何蛋白质组变化尚未得到表征。

●研究技术路线

● 研究结果

1.富含 CY3D5G 的提取物对体重和组织指数的影响

如表1所示，与NC组相比，D-Gal的注射使DG组和CH组小鼠的体重降低（p<0.05），而DG组和CH组之间没有观察到显著差异。注射 D-Gal 6 周后，与 NC 组相比，DG 组脑、肝、肾、脾和胸腺指标分别下降 11.9、26.5、24.8、20.4 和 27.0%（p < 0.05 ）。在 CH 组中，与 DG 组相比，给予富含 CY3D5G 的提取物导致组织指标增加，并且观察到肝脏指标显著增加（p < 0.05)。然而，与NC组相比，CH组的组织指标并未完全恢复。

表1 | 富含 CY3D5G 的提取物对 D-Gal 处理的衰老小鼠体重和组织指数的影响

2.富含 CY3D5G 的提取物对血清中 SOD 和 GSH-Px 活性以及 T-AOC 和 MDA 含量的影响

与 NC 组 (399.9 ± 10.7 U/mL) 相比，DG 组的 SOD 活性显著降低至 286.4 ± 27.0 U/mL ( p < 0.05)（图1A）。在 CH 组中，富含 CY3D5G 的提取物的给药将 SOD 活性从 286.4 ± 27.0 U/mL 提高到 331.2 ± 19.2 U/mL ( p < 0.05)。GSH-Px 活性为 3273.5 ± 227.9 U/mL（NC 组）、2042.2 ± 217.4 U/mL（DG 组）和 2427.1 ± 386.0 U/mL（CH 组）。GSH-Px 的趋势与组间 SOD 活性相似（图 1B）。如图1所示C、血清中DG组的T-AOC水平（5.3±1.1U/mL）显著低于NC组（9.9±0.6U/mL）（p <0.05）。CH组T-AOC水平较DG组升高11.8%。DG组的MDA（8.4±0.6 nmol/mL）高于NC组（1.7±0.4 nmol/mL），显著水平为0.05。与 DG 组相比，CH 组的 MDA 水平降低了 44.0%（图1D）。

图1 | 富含 CY3D5G 的提取物处理对调节血清中 SOD 活性

3.富含 CY3D5G 的提取物对脑、肝、脾和肾组织中 SOD 和 GSH-Px 活性以及 T-AOC 和 MDA 含量的影响

NC组和肾脏组织活动中的DG组相比显著降低。用富含 CY3D5G 的提取物处理增加了脑、肝、脾和肾组织中的 SOD、GSH-Px 和 T-AOC 活性。脑和肝脏SOD活性、肾脏GSH-Px活性和脑T-AOC活性升高（p < 0.05）。脑、肝、脾和肾组织中 D-Gal 刺激诱导 MDA的水平，而富含 CY3D5G 的提取物显著降低了 MDA 水平（p < 0.05)（图2D）。正如预期的那样，组织中的 SOD、MDA、GSH-Px 和 T-AOC 水平显示出与血清相似的浓度变化趋势。

图2 | 富含 CY3D5G 的提取物对调节脑、肝、脾和肾中 SOD 活性

4.富含 CY3D5G 的提取物对小鼠肝脏蛋白质组的影响

通过TMT标记定量蛋白组学方法定量比较了 2054 种蛋白质，243 种在一个或多个组比较中发生了显著变化 ( p < 0.05)。与 DG 组相比，22 种和 80 种蛋白质上调，而 NC 和 CH 组中分别有 47种和 127 种蛋白质下调。图 3显示了组之间的蛋白质丰度比。蛋白质根据其在GO和KEGG 数据中的功能分类进行分组。与NC组相比，腹腔注射 D-Gal 增加了 69 种参与免疫反应、糖酵解和糖异生以及脂质代谢的蛋白质的表达，并抑制了角蛋白的表达。用富含 CY3D5G 的提取物处理导致参与线粒体功能和电子传递链 (ETC) 的蛋白质下调以及参与三羧酸 (TCA) 循环、糖酵解、急性期反应 (APR)、视黄醇代谢和肌动蛋白的蛋白质上调。

图3 | DG/NC 和 CH/DG 组之间丰度差异的热图

5.通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹验证

为了验证TMT标记定量蛋白组学，七个差异表达的基因的mRNA水平,通过qPCR进行评估。如图4所示，七个基因中的四个（Uqcrb、Orm2、Saa2和Cul2）遵循 TMT 确定的显著性趋势。通过蛋白质印迹检查 Uqcrq、Cul2 和 Hp 的蛋白质水平，进一步验证蛋白质组学分析的结果。如图5所示，与NC组相比，DG组Uqcrq和Cul2蛋白水平显著升高（p <0.05）。与 DG 组相比，富含 CY3D5G 的提取物处理显著降低了 Uqcrq 和 Cul2 的水平（p < 0.05）。此外，与 DG 组相比，CH 组的 Hp 蛋白水平升高（p < 0.05）。这些结果与 TMT 分析中的蛋白质谱一致。

图4 | 七种差异表达的蛋白质和基因的 TMT蛋白组学和 qPCR 分析

图5 | 三种差异表达蛋白的蛋白质印迹分析

● 研究结论

在饮食中补充富含 CY3D5G 的提取物 6 周可增加超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力，同时抑制血清和组织中的丙二醛含量。生物信息学分析表明，电子传递链、糖酵解、三羧酸循环和肌动蛋白细胞骨架与 CY3D5G 治疗密切相关。这些发现为了解花青素的抗衰老作用提供了有用的信息，其结果可以促进花青素在食品和制药行业的使用。