Analytical Chemistry| 虚拟校正实现异质性生物组织中待测物准确定量质谱成像

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中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔·阿不力孜科研团队在Anal.Chem.上发表了一篇题为“Virtual Calibration Quantitative Mass Spectrometry Imaging for Accurately Mapping Analytes across Heterogenous Biotissue”的研究成果，采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化（空间代谢组学）和人工神经网络算法，以内源性代谢物为天然内标，建立了虚拟校正定量质谱成像分析新方法，解决了生物组织中难以均匀添加内标化合物的技术难题，实现了整体动物体内或异质性生物组织中药物（或内源性代谢生物标志物）的准确定量成像分析。

生物体各器官以及亚器官区域因其生化微环境不同使得药物离子响应有差异，尤其是异质性生物组织（肾、脑、肿瘤等）的基质效应在组织微区中差别较大。质谱成像（MSI）技术作为新型分子成像技术，可同时获得药物和代谢物的类型、含量和空间分布信息，而基质效应限制了定量质谱成像（QMSI）的发展。添加稳定同位素标记内标是校正基质效应的常用方法，但该方法成本高、样品前处理繁琐、内标化合物均匀添加困难。本研究以内源性代谢物为天然内标，建立了虚拟校正定量质谱成像（VC-QMSI）分析新方法，校正每个像素点的相对基质效应，实现准确定量成像分析。

图1 | 虚拟校正定量质谱成像分析方法

1.采用AFADESI-MSI技术（空间代谢组学）实现生物组织中药物和大量内源性代谢物同时成像检测。

2.加入相同含量药物至不同模拟组织中，选取与药物离子强度变化相关性较高的前10个内源性代谢物离子，作为天然内标；以每个像素点中天然内标相对强度为输入变量X_i，对应像素中药物相对离子强度为输出变量Y，用人工神经网络算法建立回归模型f_r=F(X_i)。

3.加入系列稀释浓度药物至模拟组织建立标准曲线样品，输入相应的X_i到回归模型f_r=F(X_i)中，计算虚拟校正因子f_r，并对药物离子相对强度I_i进行校正I_i′=I_i/f_r，建立I_i′与药物浓度的标准曲线。

4.检测并计算得到的待测组织或整体动物切片中各像素点的校正药物离子相对强度I_i′，将I_i′代入标曲中得到对应的含量，实现药物准确定量成像。

5.t-SNE-Kmeans聚类分析整体动物所有像素点，实现自动空间识别。

6.完成药物体内分布准确定量分析，进行药代动力学性质评价。

1.比较不同算法建立的回归模型，获得最佳算法。

2.对高度异质性组织微区进行虚拟校正。

3.用抗肿瘤药物甲氨蝶呤MTX和其氘代物MTX-D₃以及紫杉醇衍生物PTXCH验证VC-QMSI。

4.用三种不同特征离子集合进行Kmeans聚类分析，比较聚类和空间识别结果。

5.VC-QMSI在抗肿瘤候选药物LXY6006（LXY）和PTXCH药代动力学评价上的应用。

1.人工神经网络算法准确性最好

比较四种不同算法（主成分回归PCR、索套回归LR、支持向量回归SVM、人工神经网络ANN，图2A）建立的回归模型，各模拟器官相对基质效应的计算结果显示，LR和ANN的拟合效果最好（图2B），平均相对误差约小于10%，相关系数大于0.99；用fr逐像素校正药物离子强度后，各器官间平均药物相对离子强度的RSD小于15%，且整体动物切片f_r成像图的区域差异明显（图2C）。ANN模型具有更高的准确性，后续实验中都采用ANN回归模型。

图2 | 不同回归模型的基质效应校正因子

2.亚器官水平的虚拟校正

对高度异质性组织（肾、脑、肿瘤）中的药物进行VC-QMSI，组织切片相对校正因子RCF的可视化结果（图3A-C）和统计分析（图3D-F）显示，RCF预测值在组织亚器官区域有差异，校正后的肾髓质和肾皮质的标曲线性更好且斜率更接近（图3I），证明VC-QMSI可以校正亚器官区域的待测物离子强度，消除组织特异性基质效应的影响。

图3 | 高度异质性组织亚器官水平RCF预测

3.VC-QMSI验证

加入相同含量MTX和MTX-D₃至不同模拟组织中，虚拟校正后各组织间和像素间的MTX离子强度差异RSD均下降；加入系列稀释浓度MTX和MTX-D₃至不同模型样本（S₁-S₆）中，结果表明虚拟校正（VC）和同位素校正（IC）的标曲线性一致，r=0.9994（图4B-C）。使用VC-QMSI方法，最终得到MTX（图5B）和其代谢产物（图5C）在整体动物切片中的定量成像图。以上结果说明VC具有与IC相同的效果。以PTXCH为待测物，加入系列浓度标准溶液至不同模拟组织中，虚拟校正后的标曲线性更好，并且成功用于肌肉和肿瘤组织的校正和定量（图6）。

图4 | MTX标准曲线（A：未校正）

图5 | MTX和其代谢产物7-羟基-MTX整体动物定量质谱成像结果（A:RCF成像）

图6 | 添加PTXCH组织的线性拟合和外推结果

4.t-SNE-Kmeans聚类分析空间识别最准确

本研究建立了无监督的、基于代谢组学特征的区域聚类模型，实现更准确的自动空间识别。分别使用110个内源性代谢物离子、3个PCA成分和3个t-SNE成分作为输入变量，三者Kmeans聚类分析结果显示，t-SNE-Kmeans聚类分析方法将整体动物切片所有像素分为14个集群，且集群重叠最少（图7A）。将像素按照位置索引重构整体动物图像（图7D），发现绝大部分同一组织学区域的像素点属于同一集群。该方法可以提高定量药物分布的准确性，避免基于光学图像指导的人工组织区域选择造成的误差。

图7 | 比较不同方法的像素聚类和空间分割结果

5.药代动力学性质评价

LXY在整体动物上的定量分布如图8所示，模拟心和肺中药物响应较低，而在校正后离子化效率和其他器官达到同一水平。将VC-QMSI和TEC（组织消光系数）-QMSI的定量结果进行比较，相对误差≤±35%，两者呈线性相关r=0.9855，说明VC-QMSI可以提供药物准确定量分布情况，并且可用于未知组织的定量分析。

VC-QMSI也可应用于临床前药物研究，例如定量计算LXY不同剂型和给药方式的生物利用度。此外，我们通过可视化药物在整体动物切片中的分布情况，直观比较抗肿瘤候选药物LXY和PTXCH以及阳性药PTX的肿瘤靶向效率（图9），推测PTXCH有更好的靶向治疗效果和更低的不良反应。

图8 | LXY定量质谱成像结果

图9 | 整体动物中不同抗肿瘤药物的时空变化

VC-QMSI采用AFADESI-MSI技术（空间代谢组学）和人工神经网络算法，以内源性代谢物为天然内标，建立待测物浓度与内源性代谢物之间的相对基质效应预测回归模型，实现每个像素点的基质效应校正，从而达到准确定量质谱成像分析。该方法解决了生物组织中难以均匀添加内标化合物的难题，无需高成本的同位素内标制备和繁琐的样品前处理，且实现了整体动物或异质性组织微区中药物或生物标志物的准确定量成像分析，为新药研发或疾病诊断提供了更加准确可靠的可视化研究工具。

参考文献：

Song X，He J，Pang X，et al.Virtual Calibration Quantitative Mass Spectrometry Imaging for Accurately Mapping Analytes Across Heterogenous Bio-tissue[J]. Analytical chemistry, 2019，91(4)：2838-2846

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本文转载自“质谱成像”