Plant Cell Environ. | ​中国药科大学用质谱成像揭示银杏叶截面中独特的空间代谢组学

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中国药科大学天然药物国家重点实验室李彬教授团队在Plant Cell Environ.期刊发表的题为“Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging”的研究成果，该研究成果以银杏叶，幼茎和根为研究对象，利用高分辨率傅立叶变换离子回旋共振(FT - ICR)基质辅助激光解析电离（ MALDI）和激光解吸电离(LDI) 质谱成像技术获得了银杏叶和不同器官中代谢产物的空间化学信息，这些信息提供了关于银杏植物代谢产物的生物合成、运输和积累的重要信息，有助于我们了解几种植物次生代谢产物的生理作用。

银杏是一种古老的植物，是银杏门中唯一现存的物种，因此被认为是“活化石”。在食品、制药和化妆品行业拥有较高的经济价值，根据临床研究，银杏叶提取物具有治疗外周循环、记忆和认知功能障碍相关疾病的潜力。此外，银杏也因其高度的环境适应性和无与伦比的环境胁迫耐受性而引人注目。前期大量的研究已经确定了银杏植物内的代谢产物及其相应的生物合成途径，但是银杏代谢产物的空间化学信息仍然缺乏。

研究材料

实验对象为银杏植物的叶，幼茎和根组织。其中对银杏叶，幼茎，根组织切片样本进行了MALDI和LDI质谱成像。将银杏叶的上、下表皮细胞层进行分离，获得3个生物学重复样本（每个样本来源于5个叶切片），进行LC-MS/MS代谢物的相对定量分析。

1.利用基质辅助激光解析电离（MALDI）和激光解析电离（LDI）质谱分析银杏叶代谢产物

为了确定最佳的MALDI基质，作者使用MALDI‐ToF MS仪器，结合几种基质(DHB和CHCA为正离子模式，9‐AA为负离子模式)、基质施用量以及两种基质应用方法(自动喷雾和升华)来实现对银杏叶内代谢物的综合检测。最终选择了DHB作为银杏叶正离子模式检测的基质，因为与CHCA相比，在正离子模式下，DHB更容易检测到双黄酮、类黄酮苷和脂类物质。由于DHB基质峰对于低分子量物质的干扰，对于一些分子量较低的物质作者采用了傅立叶变换离子回旋共振基质辅助激光解析电离（MALDI FT‐ICR） 质谱进行检测。此外，用激光解析电离（LDI）质谱检测银杏叶中吸收紫外线的黄酮类化合物。同时因为测试结果显示两种基质应用方法(自动喷雾和升华)效果类似，但升华后很少观察到类黄酮苷，最终作者选择空气辅助喷雾器的基质施用方法。

图1 | 从银杏叶的横截面获得的代表性MALDI和LDI质谱图

2.MALDI / LDI 质谱成像显示银杏植物中代谢物的异质分布

在冷冻切片之前，将新鲜的叶子组织包埋在明胶溶液中，以改善可用于质谱成像的横截面（图 2）。叶片横截面的图2中的光学图像显示了其主要的区室：表皮，维管束，叶肉和分泌腔。

图2 | 银杏叶的光学图像，叶片的横截面

不同代谢物的独特空间分布概况见图3、图4、图5。图3显示了类黄酮苷元、双黄酮、类黄酮苷和双黄酮苷的二维离子强度图，这些物质主要聚集在上表皮和下表皮。

图3 | 杏叶中选择的类黄酮离子的正离子模式MALDI图像

银藻酸（GAs）和腰果酚只在高度特殊化的细胞室-分泌腔内检测到(图4)。

图4 | 银杏叶片中银藻酸（GA）离子（m / z 319.2279–373.2748）和腰果酚离子（m / z 275.2380–329.2850）的负离子模式的LDI图像

银杏内酯A (m/z 447.1052)和银杏内酯一组异构体(m/z 463.1001;银杏内酯B/J/M/ K)位于表皮和叶肉中，而黄酮类化合物仅在表皮中检测到(图5)。根据METLIN数据库的精确质量匹配，在分泌腔中发现的几个特定的m/z值被暂时指定为脂类相关离子，但是，需要进一步的工作来识别鉴定这些离子。正如预期的那样，叶绿体中的叶绿素A在图像中可见，这也是植物中特征性的绿色的原因。

图5 | 所选其他离子的正离子模式的MALDI图像

此外，也观察到了属于萜内酯的银杏内酯的器官特异性分布。如图6所示，银杏内酯A、B和/或其他异构体主要存在于根的皮层和韧皮部区域以及叶的叶肉中。简而言之。银杏内酯在根组织中含量最高，在叶和幼茎中含量依次下降。

图6 | 银杏内酯离子的正离子模式MALDI图像

3.LC-MS验证主要黄酮类化合物在表皮中的不均匀分布

如图3所示，黄酮类化合物在上、下叶表皮之间分布不均匀，表明上叶表皮中黄酮类化合物含量较高。为了验证在MALDI MSI中观察到的这种分布差异，将上、下表皮细胞层与叶片横切面分离(不含叶肉，如图7所示);然后进行提取和LC-MS /MS代谢组学分析，对各黄酮类化合物的含量进行相对定量。接着作者选择了分别属于类黄酮苷元，双类黄酮和类黄酮糖苷的9种化合物以验证成像结果。图 7显示了上表皮和下表皮之间选定类黄酮的平均含量。对均值差异的统计分析表明，表皮上层中每种选定类黄酮的相对含量均显著高于下侧（≥99.5置信度），这与在MALDI成像结果中观察到的分布模式密切相关。

图7 | 采用LC-MS法对银杏叶中上、下表皮中的9种类黄酮进行比较

尽管许多实验集中于银杏叶中生物活性成分的表征和功能分析，它们的空间分布常常无法解决。与公认的用于形态结构可视化和大分子定位（例如基因和酶）的方法不同，当大多数化合物未知或未知时，使用光学技术精确确定单个代谢物的空间分布是困难的。因此，尚未明确地确定组织中许多代谢物的生产，运输和积累的特定位点。在这里，作者证明MALDI和LDI FT-ICR 质谱成像技术非常适合用于研究银杏叶的空间代谢组。另外，为了验证观察到的上、下表皮代谢物的差异，并验证观察到的分布并不是样品制备的人工产物，作者进行了LC-MS /MS代谢组学检测，数据显示，检测到的黄酮类化合物在上表皮和下表皮之间的丰度存在类似的显著差异。

图 3显示了4类不同的类黄酮的分布模式：糖苷配基和相关的糖苷，双黄酮类和双糖苷。类黄酮化合物的分布具有一些相似之处。例如，它们分布在表皮内，在表皮上部的数量更多。据报道，类黄酮可以保护植物免受紫外线B辐射，并对食草动物起到化学屏障的作用(Rector, Liang， & Guo, 2003)。本文采用LC-MS /MS代谢组学对银杏叶片中黄酮类化合物的含量进行了定量研究，数据显示，经过4小时的辐射后，银杏叶片中目标类黄酮含量呈上升趋势，表明银杏叶片可以通过增加吸收紫外线的类黄酮来保护自身免受辐射伤害。

除了是富含类黄酮的资源外，银杏叶还含有有毒的酚类脂质（例如GA和腰果酚），可引起过敏反应。使用负离子模式LDI 质谱检测，仅在银杏叶的分泌腔中检测到了这些有毒的酚类脂质（图 2）。前期报道的在不同植物科之间也发现的植物分泌结构储存有毒代谢物这种共性。酚醛脂类，如豆蔻酸和腰果酚，已显示出抑制细菌，真菌，原生动物和寄生虫的生长，表明它们可能在化学防御机制中发挥重要作用，这些有毒代谢物可以在叶片压碎后释放出来，以保护其免受草食动物的侵害。

另一个重要的代谢物类萜烯内酯(如ginkgolides),这里主要是局部皮层和韧皮部地区的根组织和叶表皮和叶肉(图5和6)。当然,准确的质量测量不能区分同分异构体，虽然原位质谱是一种有效的同分异构体鉴定方法，但由于母离子丰度低，通常无法检测到特征片段。用MSI可视化的银杏内酯的空间分布与以前使用同位素标记，基因表达分析和组织特异性代谢产物分析等多种技术进行的研究一致。结果表明银杏内酯生物合成的位点位于根部，产物主要在叶片组织中转运和积累。此外，由于银杏内酯是一类具有重要临床应用的药理活性成分，因此获得的影像学结果可能提供有关如何通过非生物胁迫增加生物活性银杏内酯在叶片组织中的积累或建立高产量细胞培养系统的见解。

在这项工作中，利用高分辨率的傅立叶变换离子回旋共振(FT - ICR) MALDI和激光解吸电离(LDI) MSI技术，获得了银杏叶片和不同器官中代谢产物的空间化学信息。特别是银杏叶的样品制备直接关系到MSI结果的质量和真实性。本文首次从银杏叶、茎和根中全面测定了类黄酮苷元、双类黄酮、双糖苷、银杏内酯和酚类脂类等多种成分。高质量准确性和原位串联质谱(MS/MS)测量有助于识别组织切片内的代谢物。这些空间信息揭示了代谢物的功能作用，以及叶片对生物和非生物胁迫的局部响应。

本文通过质谱成像（MSI）技术获得银杏叶片和不同器官中代谢产物的空间化学信息。特别是幼茎和叶片所获得的离子图像提供了有关整个银杏植物代谢物的生物合成，运输和积累的重要信息，并且应该有助于我们了解几种植物次生代谢物的生理作用。

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小白龙 撰文

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