Science Bulletin | 空间脂质组学揭示怀孕小鼠暴露于PM2.5会导致子代小鼠认知和情绪障碍

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2020年8月，香港浸会大学化学系环境与生物分析国家重点实验室在Science Bulletin期刊发表了题为“Airborne fine particulate matter induces cognitive and emotional disorders in offspring mice exposed during pregnancy”的研究成果，该研究以C57BL/6受孕小鼠为研究对象，结合形态学、脂质组学和三维(3D)-MALDI-MSI（空间脂质组学）的分析方法被用于研究胎儿、后代和胎盘中的PM 2.5毒性，并用于识别与认知和情绪障碍相关的特定结构中的脂质标记物。

PM2.5暴露被发现穿透中枢神经系统，并通过产生氧化应激和炎症反应诱导异常行为。暴露于PM2.5可能会产生神经炎症和多巴胺神经毒性，并诱发中枢神经系统疾病。此外，怀孕期间的空气污染、营养和吸烟，会通过胎盘调节对胎儿和后代的发育产生负面影响。胎盘的主要功能是胎儿和母亲之间废物和营养的转移，其在调节胎儿-母体免疫系统和调节母体血液中的外源化合物方面起着重要作用。它还分泌激素和一些重要分子来影响胎儿的发育和生长。潜在靶器官的精确定位对于准确评估妊娠PM2.5毒性和母体PM2.5暴露诱导的子代毒性至关重要。基质辅助激光解吸/电离质谱成像(MALDI-MSI)已被用作在综合组织分析中识别各种分子以揭示空间分布和形态特征的强大工具。

1.研究材料

实验对象为小鼠，设计了组0(n=8；包括对照和PM2.5暴露)，用于在E14收集胎儿性腺(卵巢和睾丸)。组1(n=26；包括对照和PM2.5暴露)，用于收集胎盘和胎儿样本。在E18，处死怀孕小鼠，收集第1组的胎盘和胎儿。2组(n=26包括对照和PM2.5暴露)用于收集后代海马体。在出生后d49 (PND 49)，在第2组中对子代小鼠(每组26只)进行1周驯化后的行为测试。行为测试后，收集组织(每组8个)进行形态学、脂质组学和MALDI-MSI分析。

2.组学分析

LC-MS/MS脂质组+MALDI-MSI空间脂质组

3.检测方法

（1）形态学观察和行为测试；

（2）LC-MS/MS脂质组检测；

（3）MALDI-MSI空间脂质组检测；

1.PM2.5诱导后代认知和情绪障碍

本次研究，在18天的妊娠中，从E0到E18，每2天用PM2.5（实验组）或生理盐水(对照组)处理怀孕小鼠，使用PND49子代小鼠进行行为评估，包括步降试验、高架十字迷宫试验和强迫游泳试验（图1a）。如图1b所示，在d1(记忆获得期)期间，PM2.5处理组与对照组相比，雌性后代潜伏期存在显著差异(P < 0.01)，雌性后代的错误数量显著增加(P < 0.01，图1c)。在d2期，雌性子代潜伏期显著缩短(P < 0.001，图1d)，并且在雌性后代中观察到错误的数量显著增加(P < 0.001，图1e)。上述结果表明，妊娠期PM2.5暴露显著损害了雌性后代记忆的获得和巩固。焦虑样反应通过高架十字迷宫试验进行评估，显示PM2.5处理组的雌性后代的行为焦虑增加，雄性组焦虑样反应无显著性差异(P > 0.05，图1f)，表明经PM2.5处理的雄性组没有焦虑趋势。暴露于PM2.5的雄性和雌性在强迫游泳试验中保持不动的时间没有任何显著差异(图1g)。

图1 | PM 2.5暴露后对子代认知和情绪障碍的影响

2.PM2.5暴露诱导海马损伤

选择形态学变异作为分子损伤的指标，以评估PM2.5诱导的子代大脑海马损伤(图2)。采用尼氏染色法观察妊娠期PM2.5暴露对子鼠海马细胞结构的影响。与相应的对照组(图2a)相比，用PM2.5处理显著减少了PND49上雌性后代的海马角菊石1 (CA1)、CA3和齿状回(DG)区域中的神经元细胞的数量(图2b)。形态学结果还显示，除CA1区外，雄性后代海马CA3区和DG区的神经变性增加(图2c和d)。与对照组相比，PM2.5暴露导致尼氏体损伤，包括排列紊乱和细胞质减少。此外，在PM2.5处理组中检测到海马CA3和DG区域的松散连接和结构萎缩(图2b和d)。

图2 | PM2.5诱导组织损伤的形态学分析

3.子代海马和胎儿脑脂质代谢紊乱

除了形态学上的显著变化，作者还对与PM2.5毒性相关的脂质代谢机制进行了进一步的探索。为了研究脂质代谢在PM2.5损伤中的作用，采用基于LC-MS/MS质谱的脂质组学对暴露于PM2.5的组织进行分析。通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，在PM2.5处理组和对照组的后代海马和胎儿脑中发现显著不同的脂质。暴露于PM2.5后，观察到不同性别的子代和胎儿中脂质标记物的显著变化。中性鞘糖脂[CeG1]，神经酰胺[Cer]，鞘磷脂[SM]，磷脂酰肌醇[PI]，磷脂酸[PA]和磷脂酰甘油[PG]显著上调，与雄性组相比，来自PM2.5处理组的雌性子代海马中的脂质标记物增加了3.0至6.4倍。结果表明，暴露于PM2.5后不同性别的脂代谢变化可能与雄性海马调控相关的行为改变更相关。

4.子代海马的空间脂质组分布

脂质组的结果表明，PM2.5处理在小鼠海马毒性中起着关键作用。然而，尚不清楚脂质标记物的空间分布是否被重新编程，以及海马和胎儿中的异质性相关的结构是否与后代中认知和情绪障碍的产生相关。MALDI-MSI提供了一种在空间分布和丰度变化中可视化目标分子的原位方法。

通过观察子代海马形态和脂质代谢的显著变化，进一步研究了脂质的空间分布是否也发生了变化。以N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDC)为基质的MALDI-MSI和多元统计分析的结果如图3所示。PM2.5处理和对照小鼠的分割和概率潜在语义分析(pLSA)显示出明显的差异(图3a-e)。

图3 | MALDI-MSI分析后代脑中脂质标记物的丰度变化和空间分布

5.胎儿脑中脂质的空间分布

考虑到后代海马对PM2.5的暴露很敏感，作者想知道胎儿大脑是否也可能在PM2.5引起的认知和情绪障碍中发挥作用。空间分割显示胎儿大脑与胎儿其他部分明显分离(图4a-d)。

图4 | MALDI-MSI分析胎儿全身脂质标志物的丰度变化和空间分布

为了评估PM2.5暴露是否导致胎儿脑中脂质代谢物空间分布的改变，通过3D重建和多元统计方法(图5)在不同深度对照组和PM2.5处理的雌性和雄性小鼠的40-51个全身胎儿的连续切片进行组装。胎儿的连续切片结果显示，从大脑到脚(水平)，从左到右(垂直)，暴露于PM2.5后，胎儿大脑中的九种脂质标记物显示出特定的空间分布差异。令人惊讶的是，Cer (d36:2)、CerG1 (d40:1)、DAG (38:6)、LPC (18:1)、PA (36:4)、PG (42:10)、PI (38:5)和SM (d44:1)显示出清晰的分布。

图5 | 3D展示胎儿中脂质的空间分布

此外，通过在胎儿脑中使用常规的2D MALDI-MSI分析，识别出具有显著差异的脂质标记物，并将其与胎儿脑的结构定位在一起(图6)。与雄性组相比，上调的PG (42:10)、Cer (d36:2)和CerG1 (d40:1)被鉴定并共同位于背侧大脑皮层(等角皮质)和海马结构(Hpf)区域，上调的PA (36:4)和SM (d44:1)被鉴定并共同位于雌性胎儿大脑的中脑和髓质(图6)。

图6 | 雌性和雄性胎儿脂质标记物的代表性MALDI-MSI图像

6.PM2.5诱导的胎盘损害和脂质变异

鉴于后代海马体和胎儿大脑是对PM2.5诱导的行为障碍做出反应的目标器官，作者想知道胎盘功能障碍是否是由妊娠暴露于PM2.5引起的。经PM2.5处理组的形态学分析显示，与对照组小鼠相比，在雌性胎盘交界区(JZ)出现了严重的细胞损伤。妊娠期暴露于PM2.5会损害胎盘细胞结构，这可能随后破坏胎盘器官发生，诱导胎盘功能障碍并导致胚胎发育异常。在经PM2.5处理的组中，在具有95%置信区间的五个成分的pLSA图上发现具有显著差异的脂质标记物，其在包括LZ、JZ和MD的整个小鼠胎盘中不同地分布(图7a)。在PM2.5处理组中，7种脂质分布于整个胎盘并显著上调，包括SM (d34:1)、Cer (d42:1)、PE (38:4)、PE (40:6)、PS (40:6)、DAG (36:4)和三酰甘油[TAG] (54:2)。小鼠胎盘LZ中CerG1 (d34:0 + pO)的丰度增加(图7c)。

图7 | MALDI-MSI分析胎盘脂质标志物的丰度变化和空间分布

胎盘代谢途径调节胎儿大脑发育，研究结果表明，PM2.5通过胎盘功能障碍诱导了子代海马体的变异以及认知和情绪障碍。脂类在胎盘发育和形态变异中也起着关键作用，与健康胎盘相比，患者胎盘中的脂质丰度显示出不同的表达。胎盘，联系怀孕期间的母体炎症和新生儿，被认为是后代大脑发育的一个重要因素。

PM2.5通过生物分子在母体-胎盘-胎儿相互作用中的综合作用，以性别特异性差异的方式诱导认知和情绪障碍，包括上调的促炎作用、5-羟色胺合成的减少以及对GPs和SPs生物合成和降解的干扰。脂质代谢结果表明，在整个女性母体-胎盘-胎儿相互作用中，GPs(上调的PA、DAG、PG和PI，以及下调的PE)和SPs(上调的Cer和SM)的生物合成和降解受到干扰。

作者还发现，与无帕金森病的组相比，帕金森病患者的人脑脊液中9种脂质标记物的变化相同，但脑积水和脑动脉血栓形成除外。总之，从脂质标记物的变化来看，AD小鼠和人类脑脊液样品的结果与PM2.5暴露小鼠模型显示出良好的一致性。表明脂质代谢紊乱与神经退行性疾病的进展密切相

本文研究发现，PM2.5通过生物分子在母体-胎盘-胎儿相互作用中的综合作用，以性别特异性差异的方式诱导认知和情绪障碍，包括5-羟色胺合成减少和胚胎发育障碍，作者通过使用2D和3D MALDI-MSI突出了胎盘、胎儿脑和后代脑中潜在靶器官的精确定位。通过对怀孕小鼠模型的研究，阐明了妊娠期暴露于PM2.5会导致形态学损伤，以及胎盘、胎儿和后代海马体特定区域脂质谱的改变，这可能在雌性后代的认知和情绪障碍中起作用。作者还验证了阿尔茨海默病小鼠海马和人脑脊液样本中脂质标记物的变化。这项研究是第一份关于通过扰乱形态学驱动的脂质代谢而导致PM2.5诱导的行为障碍的报告。该研究提供了PM2.5毒性的有价值的信息和对分子机制的理解。

本研究通过LC-MS/MS脂质组学和MALDI-MSI空间脂质组的研究，阐明了妊娠期暴露于PM2.5会导致形态学损伤，以及胎盘、胎儿和后代海马体特定区域脂质谱的改变，这可能在雌性后代的认知和情绪障碍中起作用。

参考文献：

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Becerra TA, Wilhelm M, Olsen J, et al. Ambient air pollution and autism in Los Angeles county, California. Environ Health Perspect 2013;121:380–6.

Valentino SA, Tarrade A, Aioun J, et al. Maternal exposure to diluted diesel engine exhaust alters placental function and induces intergenerational effects in rabbits. Part Fibre Toxicol 2016;13:39.

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小鹿迷 撰文  

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