启用新一代测序化学、推出高通量流动槽，升级后的NextSeq 2000/2000-CN需要重新审视

在Illumina广泛的测序产品组合中，NextSeq系列的定位为中通量、桌面式测序系统。因其较广的通量覆盖、可支持多种应用的灵活属性，NextSeq系列特别是NextSeq 2000被锁定成为后来者竞相对标的一款测序平台。

如果回顾历史，NextSeq系列测序系统一开始就是Illumina应对当时行业竞争而创造的产品，后面成长为了行业竞争的焦点，而Illumina又通过不断创新引领了发展的新趋势。

这篇文章我们就来详解NextSeq的历史及创新发展。

Illumina NextSeq到今年初已经完整地走过了十个年头。

十年前，桌面式测序系统如雨后春笋般破土而出，为了应对如Ion Proton等带来的竞争，NextSeq应运而生。

Illumina从头设计了光学、流体学，并升级了之前的SBS化学，在2014年推出了第一款NextSeq 500，弥补了其在高通量HiSeq 2000和低通量MiSeq测序产品之间的缺口。NextSeq 500以显著降低的成本将高通量及全基因组测序带到了桌面。

NextSeq 500测序系统

NextSeq 500的发布大获成功，国内一些企业联合Illumina也专门针对中国的临床需求进行了相应的注册产品的开发，贝瑞基因NextSeq CN500于2015年就获得了医疗器械注册证，之后在全国数百家医院和临床检验机构开展无创DNA产前检测（NIPT）等项目。

发布NextSeq 500一年后，Illumina又推出了NextSeq 550系统，将微阵列扫描与NextSeq 500测序系统相结合，其最初的应用是细胞遗传学和产前基因诊断。两年后，NextSeq 550获得FDA批准，550Dx能够用于临床研究和开发体外诊断检测。NextSeq 550Dx也在2020年10月获得中国NMPA的正式批准。

在2020年的JPM大会上，Illumina宣布升级推出全新的NextSeq 1000和NextSeq 2000（两者的区别是只有2000才能运行通量更大的流动槽）。NextSeq 1000/2000的开发融入了大量技术创新，本质上Illumina又从头构建了新的NextSeq测序系统。在中国市场，Illumina持续地开展了本土化战略，实现了NextSeq 1000/2000仪器和相应耗材的本地生产及组装，推出了NextSeq 1000-CN和NextSeq 2000-CN平台。

NextSeq系列测序系统的主要参数对比

在集成的超75项创新中，NextSeq 1000/2000包含的五项重大进步是意义非凡的：蓝/绿双色通道化学、超分辨率光学器件、超高密度阵列式流动槽、集成DRAGEN Bio-IT分析平台以及用于简化工作流程的紧凑型试剂卡盒。

NextSeq 1000/2000使用阵列式流动槽，而不是之前在NextSeq 550中使用的传统随机流动槽。阵列式流动槽包含有组织的、规则排列的、超高密度纳米井，其中嫁接着寡核苷酸，进入纳米井的文库DNA会迅速进行杂交、桥接和扩增，充满整个空间且不会使流动槽过载。均匀分布的纳米井不是随机簇，更容易读取，从而能最大限度地提高信号捕获率，也简化了成像过程。

相比之前的红绿 2通道SBS仪器，NextSeq 1000/2000改用了蓝/绿荧光体，既能激发又能发射蓝色和绿色波长的光。改进的蓝/绿SBS化学物质可以更好地分离信号。使用蓝色和绿色波长滤光带对每个DNA簇进行图像拍摄，每个周期仅需要2个图像，与四色系统相比，处理时间减少了一半。

为了改进跟踪，NextSeq 1000/2000改用了超分辨率光学器件，可以更好地区分有序的纳米井和两种颜色。超分辨率光学器件能够突破衍射极限，系统经过优化后，可提高簇亮度、减少通道串扰并提高信噪比，结果是可以产生更清晰的图像。与之前的NextSeq系统相比，这带来了产量的增加并降低了每次运行的成本。

在上一代NextSeq测序系统中，液路系统将试剂从试剂盒中抽出，并将它们泵入一系列内管，以正确的顺序和数量自动将它们输送到流动槽。这种方法需要在运行之间进行清洗循环，以减少交叉污染风险。而NextSeq 1000/2000对此进行了显著的升级，彻底变为了干式系统。一个卡盒包含所有试剂、液路，并将它们输送到与卡盒嵌入卡扣在一起的的流动槽，并收集所有废液，这里没有清洗循环，没有任何试剂进入仪器主体，一个测序运行结束后可以立即装入下一个卡盒。这样一来，NextSeq 1000/2000也减少了测序反应的体积，相应地减少浪费、最大限度地减少液体的物理存储需求、提高可回收性并最大限度地减少了废物量。在操作层面上，这简化了文库加载和仪器使用，减少了用户出错的机会、提高了实验的效率。而对于Illumina来说，这样的设计也降低了维保的工作难度。

NextSeq 1000/2000简化并显著减小了卡盒的尺寸

NextSeq 1000/2000平台成为第一个集成DRAGEN Bio-IT处理的平台，开启了测序系统板载计算的先河。之前，测序运行后，用户需要导出测序输出文件并通过单独串联的或者并行的分析管道运行二级分析。现在，使用机载DRAGEN计算资源可直接在仪器上进行二级分析，适用于基因组、DNA、(单细胞) RNA、甲基化等多种常见的测序分析流程，从而省去了一些繁琐的步骤，用户也可以减少对额外计算基础设施和生物信息学资源的需求。这一实践现在已经拓展到了Novaseq X系列测序系统上。如果未来的Illumina硬件没有板载DRAGEN，那才是令人惊讶的。

NextSeq 2000相比NextSeq 550实现了性能的极大提升

可以说，NextSeq 1000/2000既是可靠的系列升级，也是创新技术的实验场。在两年后推出的NovaSeq升级版中，这些经过验证的创新技术被正式引入，为Illumina在超高通量测序系统上的竞争提供了充足的储备。

2022年初，Illumina在JPM22大会上揭示了创新的X化学，作为已经发展了十多年、成熟的SBS化学的延展和升级。X化学带来了一系列改进——更稳定的化学物质、精心设计的聚合酶、更快的循环时间、更低的定相等等。X化学之后被正式命名为“XLEAP-SBS”，成为2022年9月份发布的新一代高通量旗舰产品NovaSeq X的核心。与标准SBS技术相比，XLEAP化学使用了新型的阻断基团和连接子，能够以更快的速度和更高保真度结合这一新修饰的核苷酸，结合速度提高至2倍，阻断基团的切割速度提高至2.5倍。

与奇特的XLEAP化学物质相结合的是奇特的新光学元件—4倍像素、10倍更快的扫描速度、2倍数据传输速率、更高的分辨率（低于50纳米），这些既是传统NovaSeq所缺失的元件（也是XLEAP化学无法在NovaSeq 6000上实施的一个原因），却正是基于NextSeq 1000/2000的创新而进化来的。XLEAP化学+超分辨光学器件助力NovaSeq X实现了超高通量，再次大幅降低了人全基因组测序的成本。

NextSeq 1000/2000仪器已经拥有足够先进的光学器件，因此可以承接更高效率的XLEAP化学。

最近，Illumina宣布在NextSeq 1000/2000上全面启用XLEAP-SBS化学物质。在NovaSeq X正式推出一年以后，用户可以在中通量测序平台上采用高效的新一代测序化学。过去一年，NovaSeq X发货超350台，也就意味着XLEAP化学已经在上百个用户的实际使用中得到了重复验证。这一次，创新开始向后兼容，NextSeq 1000/2000可以享受到已验证创新技术的加持。

NextSeq 1000/2000已经拥有三个流动槽：P1可实现高达100M读取，P2等于400M读取，P3等于1.2B读取。结合这一化学升级，Illumina同时推出新型、更高输出的P4流动槽（新型P1、P2和P3 XLEAP-SBS试剂将于2024年第二季度上市）。P4流动槽能产生18亿个簇/读取，在300个循环的情况下，将产生高达540Gb的数据。

对于NextSeq产品线来说，这将是一次重大的飞跃。每个不同类型的流动槽都将能支持不同的读长，这样既保证了灵活性，又保证了相应的规模。

前面提到XLEAP化学可以实现更快的测序速度，启用XLEAP化学后，NextSeq 1000/2000的运行时间更短，使得测序周转时间快了20%。

这里需要注意的是，不同的测序平台所定义的测序运行时间是不同的，大多是只是纯粹定义为完成测序循环的时间，而采用XLEAP-SBS化学的NextSeq 2000运行时间包括在NextSeq 2000系统上的簇生成、测序和碱基检出，比如采用P1流动槽完成包括这三步在内PE150循环只需要17个小时。如果把簇生成在内的文库制备及碱基检出的二级分析步骤都包含在内，NextSeq 2000的这一用时明显低于其他竞争平台。

Illumina在NovaSeq X Plus测序系统10B和25B流动槽的实测结果已经达到了Q40>90%的可靠表现。XLEAP-SBS化学也将使NextSeq 1000/2000的Q40报告成为可能。

借助四种不同规格的流动槽，NextSeq 2000可以实现10-540Gb的数据产量，这一覆盖范围相比其他中通量测序系统来说实现了最大的区间。

不同的应用需要不同的读取深度和数据量，NextSeq 2000支持多达14种不同的流动槽配置，这使得任何测序应用程序都可以在一台NextSeq 2000系统上运行，满足了全外、全基因组、单细胞、多组学、空间组等不同的测序需求。一个中小型实验室只需要配置一台NextSeq 2000可能就够了。

借助XLEAP化学的高效和高准确率，以及P4流动槽的高通量，NextSeq 2000可以在两天内实现在P4 300c试剂盒上40x的人全基因组测序，同样地，也可以同时运行三个完整的人类基因组，比如进行家系三人组（母亲、父亲和他们生病的孩子）的基因组诊断。这为台式机开辟了许多基因组应用程序。

通过在台式测序系统上运行DRAGEN，除了可以获得三个高质量的全基因组，更重要的是，同样可以以极高的准确度执行变异识别。

P4流动槽上的XLEAP-SBS与DRAGEN 4.2一起，在40倍覆盖率下的trio WGS中，SNV精确度和召回率以及InDel精确度和召回率均达到了99.8%以上，提示了这一组合强大的变异识别性能。随着数据分析复杂性的降低，用户可以高效地在变异列表中寻找致病变异和其他关键见解。

在Illumina的手中，FPGA架构下的DRAGEN的变异识别几乎与基于GPU的DeepVariant一样好，并且比GATK更好，这使得使用Illumina+GATK进行变异识别已经显得不再合适了。

Illumina还在继续致力于优化DRAGEN的速度和变异识别精准度，并打包不同的计算管线到DRAGEN里来。随着测序系统的数据通量大幅增加，对于任何其他平台来说，询问哪些下游分析已分包给测序系统，而不需要仪器外的计算资源，以及还有什么能减少生物信息学人员的工作负担，可能逐渐成为一个凸出人性化设计的差异点。

作为一个延伸，Illumina采用区间化的Q值量表为每个碱基分配质量分数（采用三区间Q值表取代连续的整数Q值）以及ORA数据压缩，将数据占用量和存储成本减少了50%以上，同时这些对下游流程几乎没有影响，也大大减少了数据传输时间。随着测序通量及使用率提升带来数据量的涌现，数据端的降本增效需求也会越来越突出，Illumina的这一实践一定也是有参考价值的。

中通量测序系统提供了高通量测序的强大功能，以及桌面测序系统的加载和运行简单性。前面提到，Illumina的中通量NextSeq 2000近来是其他家公司瞄准竞争的目标。

一些定位与NextSeq 2000竞争的仪器看起来更像是把几个NextSeq塞在一个盒子里，提供了可扩展的更大通量，以及同时运行更多（不同规格）流动槽所带来的更大的灵活性（从文中前面的对比图可以看出）。但通过对比可以看出，叠加XLEAP化学和四种不同规格流动槽的NextSeq 2000看起来也毫不逊色。全新NextSeq 2000推出后，对于这些竞争产品来说，可能需要再去审视相应的产品差异点和销售主张。

与其他市场不太一样的是，测序市场的很多需求是在客户具体使用的过程中才逐渐冒出来的。可以说，先进入者满足了一部分需求，开辟了全新的市场，又孵化创造了新的需求，而后来者会以这些需求为创新的契机，试图去填补这些新生的需求。

但可以肯定的是，虽然被作为对标的对象，但Illumina与其他公司一样看到了（自己创造的）相同的市场需求，并通过产品的迭代正在不断填补这些需求。而这留给其他竞争者的差异化空间会越来愈小。

NextSeq将桌面测序系统的特点展现得淋漓尽致。小巧，液路部件被压缩；一个内置液路系统的集成式卡盒结合一个流动槽，加载即用；灵活，只需更换不同的卡盒和流动槽就可在不同的应用间切换；机载计算资源，简化分析。可以想象，刚接触Illumina测序系统的人会很高兴开始体验NextSeq 2000。而一旦上手，任何规模的实验室都可以更频繁地运行测序实验。

自NextSeq 1000/2000推出之后，在3年的时间里，已经累计装机近2200台。NextSeq已经无缝地融入到很多客户的流程中，日常地将测序转变成科研和临床的有效工具。市场似乎也已经准备好吸收XLEAP化学和P4流动槽带来的容量。

Illumina新任CEO Jacob Thysen讲到，随着测序越来越便宜，再一味地只通过每Gb的价格来衡量测序成本已经不合时宜了，更多地是要把上下游流程以及数据分析的成本都要考虑进去，要去衡量每个测序运行的成本。特别是，以前大家都认为试剂盒成本是一个真正的限制因素，而现在生物信息学的瓶颈正在变得明显。

Illumina要打造用户友好的端到端体验流程的完整性，希望把不同应用的工作流程设置“完全集成”到仪器的软件中，并且要“提供具有模块化软件架构的完全集成的机载分析软件”，以支持当前和未来的分析。这既是嵌入了DRAGEN的NextSeq/NovaSeq的使命，也反映了其下一步产品开发和企业发展的整体思路。

启用新一代测序化学，配套高通量流动槽，升级后的NextSeq 2000显得更加强大。

参考：

https://emea.illumina.com/systems/sequencing-platforms/nextseq.html

https://www.illumina.com.cn/systems/sequencing-platforms/nextseq-1000-2000.html

https://emea.illumina.com/company/news-center/feature-articles/agbt-2024.html

https://sapac.illumina.com/destination/Webinar-AGBT-2024-Illumina-Sequencing-Innovations-Powered-by-XLEAP-SBS-Chemistry.html

https://mp.weixin.qq.com/s/rVgCC1-uqhpz6KMBj8UVUw

https://mp.weixin.qq.com/s/jvkOvUolPPg8rS9yhunGsQ