中国医学科学院药物研究所再帕尔•阿不力孜团队：一种高灵敏、高覆盖质谱成像技术新进展

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2018年11月中国医学科学院药物研究所再帕尔·阿不力孜教授、贺玖明研究员课题组在Advanced Science发表的题为“A Sensitive and Wide Coverage Ambient Mass Spectrometry Imaging Method for Functional Metabolites Based Molecular Histology”的研究论文，通过优化的空气动力辅助解吸电喷雾质谱成像（AFADESI-MSI）技术，绘制了生物样本中超过1500种代谢物的空间分布图谱，将功能代谢物的时空变化与组织结构和生物功能联系起来，有助于分子组织学和分子病理学研究。

解析功能性代谢物在组织中的空间分布是了解生物系统中分子过程的关键。质谱成像（MSI）具有同时显示组织中已知或未知生物分子相对丰度和空间分布的能力，已广泛用于癌症和其他疾病的组织学诊断。然而，由于组织样品的复杂性和异质性，全面绘制代谢物的分布图仍然具有挑战。尤其是对于那些具有广泛生物功能但丰度较低的代谢物，需要开发一种无针对性的，高灵敏度，覆盖范围广，化学特异度高的成像方法，以可视化多种代谢物在原始状态下的空间分布。本课题组对自主研发的气流辅助解吸电喷雾电离质谱成像（AFADESI-MSI）进行了优化，通过非靶向分析，在大鼠脑、肾脏和人食道癌组织中观察到数千种代谢物，为分子组织学研究提供了有力的分析工具。

1.AFADESI-MSI喷雾溶剂系统的优化

自制的AFADESI离子源与高分辨率Q-Orbitrap质谱仪结合使用。设计了可重复的组织匀浆模型，以优化喷雾溶剂系统。图1中显示了不同喷雾溶剂系统中代表性内源性代谢物的MSI。结果显示ACN/H2O（8:2）为检测的最佳溶剂，且高速气流可显著提高代谢物的离子强度。研究通过优化后的AFADESI-MSI检测到了1500多种代谢物，包括胆碱，多胺，氨基酸，肉碱，核苷，有机酸，碳水化合物，脂质和其他小分子代谢物。

图1 | 喷雾溶剂系统的优化

2.优化后的AFADESI-MSI具有高灵敏度、高覆盖度、动态范围宽和高特异性的特点

AFADESI引入了高速气流显著提高了检测的灵敏度。硫苷脂（STs）在脑和肾脏疾病中起重要作用。图2显示ST位于肾脏的肾髓质中，而在大鼠大脑中，STs主要存在于胼胝体和内囊。此外，研究第一次报告了低丰度化合物C20:0-OH-ST在肾髓质的特异性分布，进一步说明AFADESI-MSI的高灵敏度扩大了的检测范围。

图2 | 硫苷脂（STs）在大鼠脑和肾中的提取离子色谱（EIC）轮廓和MSI

较宽动态范围有助于提供精确的代谢产物分布。应用非靶向AFADESI-MSI方法在对功能代谢物的检测中实现了超过三个数量级的动态范围。图 3显示甜菜碱及其同位素离子的离子峰强度分别为1.2E⁶，6.7E⁴，5.1E³和1.1E³，并显示出清晰一致的髓质特异性分布。

图3 | 大鼠肾脏中甜菜碱及其同位素离子的MSI

在MSI中，低丰度代谢物的空间分布常常被m/z接近的高峰度离子所掩盖。课题组应用功能强大的成像软件（Δm/z = 0.001）和高质量分辨率质谱仪确保了不同代谢物的精确成像。图4显示了三种m/z非常接近的代谢物在大鼠肾脏中的特异性分布。其中m/z 808.5143（红色）和m/z 808.5557（绿色）在脑中表现出互补的空间分布。

图4 | 大鼠肾脏和大脑中m/z接近的代谢物MSI

3.基于代谢物的分子组织学研究

原位分析组织中功能代谢产物的空间分布有助于病理诊断、药物机制研究和生物标志物发现。大鼠肾脏的分析结果显示，肌酐作为肾功能的重要指标仅分布在肾盂。甜菜碱[M+H]⁺在髓质中显示出较高的强度，但[M+Na]⁺几乎完全出现在髓质中，这与髓质中钠盐的重吸收是相符合的。此外，研究发现核苷主要分布在皮质，而核苷酸在肾髓质中显示出较强的离子强度，提供了有关髓质中核苷酸循环机制的信息（图5）。

图5 | 大鼠肾脏中代表性代谢物的MSI

大脑有复杂精细的微区结构。研究显示，脂质和许多小分子代谢物的分布与大脑的特定解剖结构显示出高度的相关性（图 6）。腺苷是一种重要的神经调节剂，在胼胝体、下丘脑和丘脑中强度较低，而在端脑和小脑中含量很高。脂质，特别是磷脂（PLs）在大脑中表现出特定的空间分布。例如，磷脂酰胆碱（PC）‐36:1，磷脂酰丝氨酸（PS）‐36:1和磷脂酸（PA）‐34:1几乎仅出现在胼胝体和内囊中，而磷脂酰乙醇胺（PE）‐40:6表现出完全相反的空间分布。

图6 | 大鼠脑中代表性代谢物的MSI

原位代谢谱分析有助于深入理解代谢重编程和肿瘤的发展机制。课题组通过AFADESI-MSI分析食管癌组织的冷冻切片，结果表明精胺和亚精胺在癌组织中被上调，对应肿瘤强大的增殖能力。谷氨酰胺作为癌细胞中主要的三羧酸（TCA）循环碳源也显示出在肿瘤组织中的大量消耗。此外，研究发现某些代谢物表现出上皮特异性分布。例如，N1-乙酰基亚精胺，L-肉碱C3:0，L-肉碱C4:0，L-肉碱C5:0，硫酸胆固醇主要分布于癌旁上皮（图 7）。

图7 | 食管癌组织中代表性代谢物的MSI

研究开发了一种灵敏且覆盖度广的AFADESI-MSI方法，用于原位分析组织上的代谢物并发现特异性生物标志物。通过优化喷雾溶剂系统，在组织切片上检测了到包括胆碱，氨基酸，肉碱，核苷，碳水化合物，硫酸胆甾醇，脂质在内的1500多种代谢物。AFADESI-MSI不仅可以提供与解剖学相关的代谢物的质谱信息，还可以帮助阐明分子水平的病理机制，从而揭示代谢物特定分布与结构和功能特征之间的联系。该方法具有覆盖范围广，灵敏度高，动态范围宽和特异性强等优点，在空间代谢组学研究和分子组织学分析中显示出广阔的应用前景。

基于AFADESI-MSI的分子组织学检查方法可在1cm×1cm的组织切片中在40分钟内提供数千种代谢物的空间信息。毫无疑问，这种快速高通量无需标记的质谱成像方法将为生物组织中代谢物的空间分布研究提供有力的研究工具。再帕尔·阿不力孜、贺玖明课题组针对其自主研发的MSI技术不断的优化改良，结合生物信息学，发展为空间代谢组学方法，有望促进具有空间异质性相关的生物学问题的解答。

参考文献：

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小周 撰文  

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