客户文章 | 氧化脂质助力心肌病研究

● 期刊：Circ. Res

● IF=15.8

● 发表时间：2020-04-30

前言

4月30日，浙江大学医学院王福俤与闵军霞团队在心血管领域国际著名学术期刊《Circulation Research》发表了内容为“心脏铁蛋白H缺失通过Slc7a11介导的铁死亡促进心肌病”的研究论文。荣幸的是，文中用到的氧化脂质代谢检测是迈维代谢提供的氧化脂质检测。今天小迈就带大家看下本文是如何研究心肌病机制的。

研究背景

维持铁稳态对正常心脏功能至关重要。铁缺乏和铁超载都与心肌病和心力衰竭的复杂机制有关。虽然铁蛋白通过储存多余的细胞铁在铁代谢中发挥核心作用，但铁蛋白在心肌细胞中的分子功能仍不清楚。本研究探讨铁蛋白H (Fth)在调节心脏铁稳态和心脏病中的作用。

研究思路

实验结果

01

构建模式小鼠、MCK-Cre介导的心肌细胞Fth缺失

将 Fthflox/flox 小鼠与表达Cre酶的MCK-Cre转基因小鼠杂交，诱导MCK-Cre驱动的心肌细胞特异性缺失Fth。产生FthMCK/MCK and Fthflox/flox （对照）后代。定量实时PCR分析证实了肌肉细胞中特异性Fth表达的丢失，结果显示FthMCK/MCK小鼠心脏或腓肠肌中几乎没有Fth mRNA，在FthMCK/MCK小鼠的心脏组织中几乎没有检测到Fth蛋白。

02

FthMCK/MCK小鼠出现轻度心肌病

测量了心脏损伤的四种生物标记物，血清天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白I（cTn-I）和肌酸激酶MB（CK-MB）的水平，发现FthMCK/MCK小鼠的四种心肌酶在6个月龄时均显著高于对照小鼠（图1A-D）。与这些结果一致，6个月大的FthMCK/MCK小鼠也增加了Nppa、Nppb和Myh7的心脏表达，这三个基因与心力衰竭相关（图1E-G）。然而，与此相反，FthMCK/MCK小鼠在2个月或6个月大时均未出现心脏增大（定义为心脏/体重比增加）（图1H），尽管心脏组织切片的天狼星红染色显示FthMCK/MCK小鼠在6个月大时有显著的心脏纤维化。

图103

FthMCK/MCK小鼠出现心源性缺铁并增加ROS的产生

与对照小鼠相比，FthMCK/MCK小鼠在2个月和6个月龄时降低了心源性铁水平（图2A），但血清或骨骼肌铁水平没有变化（图2B-C）。FthMCK/MCK小鼠的心肌铁代谢受损还表现为转铁蛋白受体1（由Tfr1基因编码）的显著下调和心肌组织中铁转运蛋白（由Fpn基因编码）的上调（图2D-G）。此外，FthMCK/MCK小鼠的心脏缺铁症伴随着氧化应激的增加，ROS解毒系统中涉及的一系列基因上调（图2H）。这些结果表明，心脏铁蛋白的铁储存功能在维持心脏铁稳态和保护机体免受氧化应激中起着关键作用。

图204

补铁可引起FthMCK/MCK小鼠严重的左心室肥厚和心肌损伤

心力衰竭患者的心肌铁含量和Tfr1表达常降低，然而，给这些患者补铁的临床疗效仍有待商榷。为了检验补铁是否对临床有益，我们给FthMCK/MCK小鼠喂高铁饮食（HID）4周。尽管HID治疗显著提高了两种基因型的心脏铁水平，但与HID喂养的对照组小鼠相比，HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的心脏铁积累较少。令我们惊讶的是，膳食铁的补充并没有改善临床结果，反而产生了灾难性的后果，与HID喂养的对照组小鼠相比，HID喂养的FthMCK/MCK小鼠出现了显著的左心室（LV）肥大和心脏/体重比增加（图3A-C）。HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的肺/体重比和肺充血也增加（图3D）（这些是心力衰竭的典型症状）。HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的心功能严重受损，表现为血清心肌酶升高（图3G-J）和3种左室肥大基因标记物表达增加（图3K-M）。此外，我们使用超声心动图来观察心脏结构和评估心脏功能，发现HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的射血分数（EF）和缩短分数（FS）显著降低（图3N-P）。组织学分析证实，HID喂养的FthMCK/MCK小鼠出现左室肥厚，特别是左室游离壁和室间隔，肌纤维紊乱，间质纤维化（图3Q）。在超微结构方面，电镜显示，HID喂养的FthMCK/MCK小鼠心肌细胞线粒体紊乱，嵴密度降低（图3R）。

图305

铁死亡与HID饲养的FthMCK/MCK小鼠铁诱导心肌病有关   

为了确定FthMCK/MCK小鼠心力衰竭发生的分子机制，我们对对照组（Fthflox/flox）和喂食ND或HID饮食的FthMCK/MCK小鼠进行了RNA序列分析（图4A）。有趣的是，KEGG富集分析表明，铁死亡和谷胱甘肽（GSH）代谢在Fth缺乏小鼠心肌病中起重要的致病作用（图4B-D）。对HID喂养的FthMCK/MCK小鼠使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定的心脏GSH水平，发现其降低（图4E-G）。鉴于GSH水平降低可触发铁蛋白沉积，我们测量了参与GSH合成和信号传导的几个关键基因的表达，发现心脏Slc7a11表达降低（图4H，I），心脏Gclc、Gclm和Gsr表达增加。Slc7a11基因与Slc3a2基因一起编码胱氨酸/谷氨酸转运体，从而调节细胞内GSH的产生。因此，在HID-fed的FthMCK/MCK心肌细胞中Slc7a11表达下调导致胱氨酸摄取显著减少（图4J）。此外，我们用免疫组织化学方法测定铁死亡症终产物丙二醛（MDA），发现HID喂养的FthMCK/MCK小鼠心脏组织中的MDA含量增加，表明脂质过氧化水平增加（图4L）。铁死亡的诱导需要多不饱和脂肪酸（PUFAs）的氧化，它们是具有生物活性的氧化脂质的前体。因此，我们使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）来测量HID饲养的对照组和FthMCK/MCK小鼠的心脏氧化脂质。与之前的报告一致，我们发现在几种心脏氧化脂质（图4M）以及氧化花生四烯酸（AA）代谢物12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）和15-HETE（图4N）的水平增加方面存在显著差异。令人惊讶的是，我们还发现HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的心脏组织中氧化二十二碳六烯酸（DHA）、α-亚麻酸（ALA）和γ-亚麻酸（GLA）的含量显著低于HID喂养的对照小鼠（图4M）。进一步分析显示，HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的7-羟基-二十二碳六烯酸（7-HDHA）、9-羟基十八碳三烯酸（9-HOTrE）和13-HOTrE（图4O-U）的心脏水平也显著降低，鉴于9-HOTrE和13-HOTrE具有抗炎特性并能抑制ROS的产生，这可能具有临床相关性。

图406

铁抑素-1可预防铁过量引起的FthMCK/MCK小鼠心脏损伤

为了验证铁死亡在HID喂养的FthMCK/MCK小鼠肥厚性心肌病中起致病作用，我们测试了选择性铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）在HID喂养FthMCK/MCK小鼠4周时腹腔注射Fer 1对心脏损伤是否有保护作用。我们发现，通过降低血清AST、CK-MB和LDL水平（图6C-E），Fer-1治疗显著保护HID喂养的FthMCK/MCK小鼠免受左室肥厚（图6A-B）以及心肌损伤和心肌细胞死亡的影响。此外，与未经治疗的HID-fed FthMCK/MCK小鼠相比，Fer-1治疗的HID-fed FthMCK/MCK小鼠显著降低了与心力衰竭相关基因的心脏表达（图6F-I），减少了心肌纤维化和肥大（图6J），并减少了心肌细胞线粒体损伤（图6K）。

图607

高表达Slc7a11可降低HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的心脏铁死亡

先前的研究表明，SLC7A11在调节肝细胞和某些癌细胞的铁依赖中起重要作用。因此，我们检测在心肌细胞中过表达该蛋白是否可以减少心肌细胞中的铁沉积。正如预期的那样，心肌细胞中Slc7a11的过度表达恢复了HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的心脏GSH（图7D，E）和胱氨酸水平（图7F）并降低了铁死亡（即心脏PTGS2mRNA降至对照水平）（图7G）。此外，过度表达Slc7a11可预防心脏肥大（图7H），并降低心肌酶至控制水平（图7I-K）。重要的是，在HID喂养的FthMCK/MCK小鼠中，EF和FS的降低反映了心脏收缩功能的受损，而心肌细胞中Slc7a11的过度表达则阻止了这种受损（图7L-N）。最后，过度表达Slc7a11可完全防止HID喂养的FthMCK/MCK小鼠的心肌纤维化（图7O）。综上所述，这些发现与我们通过药物阻断铁死亡获得的结果一致，并表明心肌细胞中过表达Slc7a11可抑制心肌铁死亡，并可预防心力衰竭，从而改善铁沉积条件下Fth缺陷小鼠的心功能。

图7

实验结论

心肌细胞缺铁模型FthMCK/MCK小鼠引发小鼠患心肌病；给此模型小鼠补铁，不能改善其心肌病症状，反而引起此模型小鼠严重的左心室肥厚和心肌损伤；铁死亡、谷胱甘肽代谢与HID饲养的FthMCK/MCK小鼠铁诱导心肌病有关；Slc7a11的下调是诱发Fth敲除小鼠心脏铁死亡的关键，铁蛋白和Slc7a11有望成为治疗铁死亡相关心脏疾病的重要靶点。

科研延伸

氧化脂质在动物体内有多种重要功能，跟炎症、氧化应激、肿瘤发生、血管生成、凝血等密切相关，但其含量低、易氧化、同分异构体多，所以检测困难。迈维代谢优化实验方法，用71种标准品，28种内标，提供71种氧化脂质和其上游多不饱和脂肪酸的绝对定量检测。