动物专题 | 转录组+代谢组解析FASN在鹅卵泡发育过程中对鹅颗粒细胞的影响

GCs（颗粒细胞）作为卵巢卵泡的重要组成部分，在维持卵泡发育中起着重要作用。以往的研究大多集中在GCs的凋亡和甾体生成，而较少关注GCs的从头脂肪生成(de novo lipogenesis, DNL)过程。DNL作为脂质代谢过程中的一个重要步骤，在细胞的各种生理过程中发挥着重要作用。哺乳动物GCs中的DNL是近年来的研究热点，但与哺乳动物相比，鸟类GCs中的DNL研究非常有限。然而，鸟类GCs中的DNL可能更复杂，因为卵泡成熟伴随着蛋黄的积累，这需要大量的脂类。我们前期研究表明，DNL中的关键限速酶脂肪酸合成酶(FASN)在不同卵泡大小的鹅的GCs中表现出发育阶段依赖的表达模式。因此，我们推测FASN介导的脂代谢可能参与了鹅卵泡发育的调控。

我们最近的研究表明，FASN干扰通过抑制类固醇性急性调节蛋白(STAR)的表达来抑制鹅GCs P4的生物合成，而FASN过表达由于FASN产物的脂毒性而促进其凋亡。然而，FASN如何调节鹅GC生理功能的机制仍然是未知的。

本研究首次通过LC-MS/MS和RNA-Seq分别研究了FASN过表达和FASN干扰鹅GCs的代谢组和mRNA转录组谱。这一综合分析有望阐明FASN调节phGC和hGC功能的潜在机制的异同，并确定这些调节中的关键代谢产物。

为了确定转染效率，分别将pEGFP-N1- FASN、pEGFP-N1、siRNA-FASN和siRNA-NC转染到phGCs和hGCs中。然后，通过qRT-PCR验证FASN过表达和干扰的有效性。对于过表达组，在phGCs和hGCs中FASN的表达水平分别增加到对照组的78倍和330倍。对于干扰组，与对照组相比，phGCs和hGCs中的FASN表达水平分别下降到0.42-和0.37倍。

经质量控制，LC-MS/MS从48个检测样品中共得到1700种代谢物。在本研究中，在FASN过表达的phGCs和hGCs中分别鉴定出63和54种差异代谢物。在FASN干扰的phGCs和hGCs中分别鉴定出36种和35种差异代谢物(表1)。

表1 差异代谢物的数量

为了探索受FASN影响的潜在代谢通路，我们使用超几何检验对差异代谢物进行KEGG通路富集分析(表2)。在这四组中，差异代谢物分别富集了8条、13条、2条和23条KEGG通路。在FASN过表达的phGCs中，差异代谢物显著丰富了嘧啶代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢通路。然而，在FASN过表达的hGCs中，KEGG通路没有明显富集。在FASN干扰的phGC中，生物素代谢途径显著富集。血清素能突触、神经活性配体-受体相互作用、间隙连接、味觉转导、炎症介质调节TRP通道、cAMP信号通路、突触囊泡周期、PPAR信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号通路、血管平滑肌收缩、肾素分泌和唾液分泌通路在FASN干扰的hGCs显著富集。

表2 差异代谢物显著富集KEGG通路

为了揭示FASN过表达或干扰在鹅GCs中引起的转录变化，进行了RNA-Seq分析。结果表明，FASN过表达后，在phGCs和hGCs中分别鉴定出1099和591个差异基因。FASN干扰后，在phGCs和hGCs中分别鉴定出224和161个差异基因(表3)。这些结果表明，当进行FASN过表达而不是干扰时，转录组的多样性更高。为了验证RNA-Seq的准确性，选择了12个基因进行qRT-PCR，结果显示这些基因的表达模式与RNA-Seq相似(图1)。

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图1 12条差异基因的的qRT-PCR和RNA-Seq分析结果

为了确定FASN对鹅GC功能的影响，选择所有的差异基因进行GO富集和KEGG通路分析。在FASN过表达的phGCs和hGCs中，差异基因显著富集的GO条目包括凋亡过程、细胞死亡、免疫应答、免疫系统过程等(图2A,C)。提示FASN过表达可能对GCs的免疫和凋亡有重要影响。在两类GCs中被这些差异基因显著富集的KEGG通路包括单纯疱疹感染、甲型流感、nod样受体信号通路、toll样受体信号通路、神经活性配体-受体相互作用等(图2B,D)。

在FASN干扰的phGCs中，差异基因显著富集的GO条目包括g蛋白偶联受体信号通路、细胞粘附、生物粘附等(图2E)。这表明FASN干扰可能对phGCs的跨膜信号转导有重要影响。这些差异基因显著丰富的KEGG通路包括神经活性配体-受体相互作用、甲型流感病毒、类固醇激素生物合成和铁衰(图2F)。在FASN干扰的hGCs中，差异基因显著富集GO条目包括磷脂分解代谢过程、细胞脂质分解代谢过程、g蛋白偶联受体信号通路等(图2G)。提示FASN干扰可能对hGCs的脂质代谢和跨膜信号转导有重要影响。这些差异基因显著富集的KEGG通路包括亚油酸代谢、α -亚麻酸代谢等(图2H)。

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图2 差异基因富集分析结果

筛选FANS过表达phGCs和hGCs中常见的差异基因富集的KEGG通路，包括单纯疱疹感染、甲型流感、节点样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、rig - i样受体信号通路、胞质dna感知通路、细胞粘附分子(CAMs)、Toll样受体信号通路、坏死(图3)。这9条通路均与免疫或坏死有关。

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图3 在FASN过表达的phGCs和hGCs中显著富集通路的交集

为了进一步探索差异基因之间的相互作用，我们筛选出了这9个通路中的差异基因，并使用Cytoscape软件构建了相互作用网络。根据节点的评分，我们确定信号传感器和转录激活因子1 (STAT1)、干扰素调节因子7 (IRF7)和toll样受体3 (TLR3)是FASN过表达的phGCs和hGCs相互作用网络中排名前三的枢纽基因。然后分别与STAT1、IRF7、TLR3相互作用的差异基因，绘制网络图。在phGCs中，网络显示相互作用主要分别发生在16个免疫基因、7个细胞因子-细胞因子受体相互作用基因、7个坏死基因和5个凋亡相关基因之间(图4A)。在hGCs中，网络显示相互作用主要发生在15个免疫-、6个坏死-、4个凋亡-和5个细胞因子-细胞因子受体相互作用相关基因之间(图4B)。然而，由于在显著富集的KEGG通路中发现了少量的差异基因，因此未能构建FASN干扰的phGCs和hGCs的相互作用网络。

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图4 核心基因的相关性网络分析

RNA-Seq分析显示FASN过表达激活了phGCs中神经活性配体-受体相互作用信号通路，上调了HTR4、HTR 6和HTR7 (5-HT受体4,6,7，神经活性配体-受体相互作用信号通路成员)的表达。此外，FASN过表达增加了5-羟色氨酸(5-HT的代谢物)的含量，而phGCs培养基中5-HT的含量并没有降低(图5A)。FASN干扰还激活了hGCs中的神经活性配体-受体相互作用信号通路，下调了HTR1B和HTR4 (5-HT受体1B和4，神经活性配体-受体相互作用信号通路的成员)的表达。此外，FASN干扰增加了hGCs培养基中5-HT的含量(图5B)。

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图5 FASN对鹅GC功能的影响

结果表明，过表达FASN可通过激活phGCs中的TLR3/IRF7和TLR3/NF-κB通路促进促炎因子的表达，但仅通过激活hGCs中的TLR3/IRF7通路促进促炎因子的表达。然后分别通过JAK/STAT1途径(炎症因子诱导)和BAK/caspase-7途径触发坏死和凋亡。结合代谢组和转录组分析发现，FASN通过激活两类GCs中的神经活性配体受体相互作用途径，仅改变phGCs中色氨酸的代谢途径，从而影响GCs对5-羟色胺(5-HT)的需求，最终参与调节鹅GCs的生理功能。综上所述，本研究表明FASN调控鹅phGCs和hGCs生理功能的机制相似，但也存在一些不同的特点。

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