项目文章 | Circulation发表华中科技大学同济医学院夏家红和吴杰团队心脏移植排斥反应重大成果

肝脏通过PCSK9/CD36途径调节心脏移植排斥反应的新机制

●期刊:Circulation

●发表日期：2023.5.26

●影响因子:39.9

●组学服务：单细胞转录+全谱+蛋白组+转录组

2023年5月26日，《Circulation》（IF= 39.9）在线发表了华中科技大学同济医学院附属协和医院夏家红、吴杰团队的重大科研成果。该研究报道了心脏移植排斥反应（Heart Transplant Rejection，HTR）中肝脏通过PCSK9/CD36通路进行免疫调节的新机制，提示该通路的调节可能是HTR的潜在治疗靶点。迈维代谢为本篇文章提供单细胞转录组+转录组+蛋白组+全谱代谢组技术服务！

研究背景

心脏移植是治疗难治性终末期心脏病最有效的方法，心脏移植排斥反应(Heart Transplant Rejection, HTR)是导致心脏移植预后不佳的最主要原因。以往的研究主要集中在移植物和免疫器官中的免疫细胞上，而忽略了非免疫器官和相关分子在心脏移植排斥反应中的作用。

通过收集临床心脏移植患者和心脏移植小鼠受体血清进行ELISA检测，发现在HTR期间受体内的PCSK9水平显著升高，Pcsk9敲除延长了雄性和雌性小鼠的心脏移植物存活率，并减少了炎症细胞的浸润和肌细胞损伤（图1C和1D以及图S1C）。通过进行RNAseq，我们发现在敲除Pcsk9小鼠的移植物中，编码免疫细胞、转录因子和与炎症相关的细胞因子的基因水平明显降低（图1E）。

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图1 敲除PCSK9缓解心脏移植排斥反应

为了探索移植后PCSK9的起源，分析了受体小鼠多个器官（移植物、肝、肾、肺、脾、淋巴结）的组织学特征以及PCSK9基因和蛋白表达（图2A），免疫组织化学分析证实，心脏移植后，PCSK9主要在受体肝脏中表达，同时蛋白质印迹验证了在HTR过程中肝脏中PCSK9的上调（图2B）。此外，进行了多器官RNA-seq分析，发现肝脏中的差异表达基因（DEG）比其他受体器官多得多（图2C和图S8B）。后利用使用多组学方法（转录组学、蛋白质组学和代谢组学）来研究HTR过程中肝脏的特征。肝的脂肪酸和胆汁酸代谢在HTR期间受到抑制，并且心脏移植小鼠肝脏的TNFα信号通路以及IFNγ信号通路发生显著变化。

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图2 心脏移植受体小鼠多器官组织学及多组学分析

肝脏是一个由各种细胞（包括肝细胞、星状细胞和内皮细胞）组成的多功能器官。通过在HTR期间对受体肝脏进行了单细胞RNAseq分析。根据典型标志物的表达，受体肝脏的细胞被聚类为9个聚类（图3A和图S11A和S11B）。通过进行KEGG和GSEA富集分析，发现主要富集在TNFA_NFKB_SIGNALING, INTERFERON_GAMMA_RESPONSE途径中。

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图3 心脏移植排斥反应期间小鼠肝脏的单细胞RNA测序分析

为了阐明肝细胞中炎症途径的激活是否由HTR期间的细胞因子风暴引起并促进PCSK9的表达，在移植后第6天对受体小鼠的血清进行了多重细胞因子测定，发现促炎细胞因子（如IFN-γ、TNF-α）的水平显著增加（图4A）。接下来，通过在体外用这些细胞因子刺激原代小鼠肝细胞，研究发现TNF-α和IFN-γ诱导了PCSK9的mRNA表达（图4B和图S12A）。此外对联合和不联合治疗的肝细胞进行了RNA-seq，鉴定了268个DEG，包括158个上调和110个下调基因（图4D）。我们验证了TNF-α和IFN-γ联合治疗后24小时，肝细胞中SREBP2蛋白质和RNA水平均显著增加（图4F）。

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图4 TNF-α和IFN-γ通过SREBP2促进肝脏细胞中PCSK9的表达

为了阐明PCSK9在HTR期间促炎作用的潜在机制，分析包含人类心肌内膜活检数据的微阵列数据集（GSE124897），在排斥移植物和无排斥移植物之间的心肌内膜活检中，只有CD36的表达存在显著差异（图5A和图S14A）。为了进一步研究CD36在心脏同种异体移植物中的细胞水平定位，对CD45+移植物浸润免疫细胞进行了单细胞RNAseq分析，发现CD36主要在移植物浸润巨噬细胞中表达（图5B和图S14C）。通过构建小鼠心脏移植模型，对移植物浸润的巨噬细胞进行检测发发现PCSK9不仅控制CD36的表达和脂肪酸摄取，而且增强巨噬细胞的促炎表型和功能，进而影响效应T细胞的增殖和IFN-γ的产生。

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图5 PCSK9影响CD36的表达和巨噬细胞功能

通过临床患者和心脏移植小鼠模型分析，发现在HTR期间，受体血清的PCSK9水平升高，抑制PCSK9能够减轻HTR。通过多器官筛选，证实HTR期间PCSK9主要来源于受体的肝脏。通过肝脏多组学和体外实验研究，发现TNF-α和IFN-γ通过SREBP2协同促进肝细胞PCSK9的表达。机制研究证明PCSK9是以CD36依赖的途径调节巨噬细胞功能。这些结果揭示了HTR期间受体肝脏通过PCSK9/CD36通路进行免疫调节的新机制，并提示该调节通路可能是HTR的潜在治疗靶点。