Nat Med | 癌细胞系新陈代谢的整体格局——928个癌细胞系的全面代谢分析

从培养的CCLE细胞系中提取代谢产物 >>

来自20种主要癌症类型的928种癌细胞系在体外培养，用于124种极性和101种脂质的代谢组学分析(图1a)。使用亲水相互作用色谱和反相色谱分析提取的极性和脂质代谢物(图1b)。基于14个具有生物重复的细胞系估算了变异系数(CV)，并发现225种代谢物中有221种的CV< 0.1(扩展数据图1a)，这表明对大多数特征代谢物的估算是可重复的。

接下来，我们使用层次聚类评估了细胞系之间的代谢相似性。这两个主要的聚类与造血系统和非造血系统有很强的相关性，这表明这两个组中的主要代谢差异。

为了进一步量化代谢物水平(y)与主要癌症谱系(X)的关联程度，我们采用了线性回归模型(方法)。结果显示，225种代谢物中的148种具有大于0.1的谱系效应(定义为r²)，表明对于这些代谢物，至少10%的跨细胞系代谢物水平差异与谱系相关。

为了获得谱系特异性分布，我们估计了主要癌症谱系中每种代谢物的平均丰度。这种方法导致了模型癌细胞系中代谢物水平的定量的、跨谱系的观点。例如，磷酸肌酸在食管细胞系中积累，但在肾或造血谱系中不积累。相比之下，1-甲基烟酰胺在大多数肾和胸膜细胞系中高度丰富，但在具有多个异常值的许多其他谱系中较低。

 这些数据表明，谱系差异存在于模型癌细胞系中，并能影响跨细胞系的代谢比较。

Fig. 1 | The CCLE database enables quantitative metabolomic modeling in relation to genetic features

代谢物与遗传特征的关系 >>

除了谱系事件，癌症中的遗传或表观遗传事件也可能改变细胞代谢。为了确定可能归因于遗传差异的代谢变异，我们设计了一个遗传特征矩阵，包括705个基因突变和61个扩增或缺失。为了寻找这些遗传特征和代谢物水平之间的联系，应用了控制谱系效应的线性回归模型(图1c和方法)。遗传特征通过与每种代谢物的关联进行评分，并且可以按照统计显著性的顺序进行比较。有趣的是，我们发现机械相关的特征通常与异常代谢物水平表现出很强的相关性。下面讨论选定的例子。

首先，我们的无偏比较揭示了预期的发现，即对于2-羟基戊二酸(2HG)，IDH1热点错义突变是一个最重要的预测性遗传特征(图1d)。这种代谢物异常积累的细胞系主要是IDH1或IDH2突变体(图1e)，概括了已知的关系。值得注意的是，尽管在CCLE肾细胞癌细胞系中没有已知的IDH1/IDH2突变体，但是额外的谱系效应分析显示，平均而言，肾细胞癌细胞具有比其他细胞系高三倍的2HG水平。这一发现与肾细胞癌肿瘤中2HG增加的观察结果一致。我们的分析还显示，KEAP1突变是与谷胱甘肽(谷胱甘肽/GSSG)和NADP+最密切相关的遗传特征。平均而言，具有突变的KEAP1的癌细胞系具有大约两倍高的这些氧化还原代谢物水平，表明获得了对氧化应激的缓冲能力。与KEAP1和IDH1改变的强相关性不同，值得注意的是，当使用无偏分析进行查询时，包括EGFR、KRAS、NRAS、TP53、PTEN和TSC1/2在内的许多常见致癌事件与所分析的代谢物之间的相关性从弱到不显。

在拷贝数分析中，使用苹果酸作为例子，我们显示最强相关的特征是ELAC1和ME2的缺失(图1f)。这些基因共定位在18号染色体上肿瘤抑制基因SMAD4周围的0.4 Mb区域，并且经常被共缺失(图1g)。ME2(苹果酸酶2)催化苹果酸氧化脱羧为丙酮酸。在含有纯合缺失的细胞中，其mRNA水平被消除，导致与较高苹果酸水平的相关性。

总之，这些结果使得代谢物和各种遗传特征之间的无偏向的关联分析成为可能，并且证实了以前的发现，即致癌性变化(例如，IDH1、KEAP1、ME2)与异常代谢物水平相关。

DNA甲基化调节代谢物的丰度 >>

接下来，我们检测了DNA甲基化并评估了其与代谢物水平的关系。2114个基因的基因转录物与其启动子CpG甲基化水平显著相关，考虑到这些选择的基因可能通过DNA甲基化进行调控，因此被纳入本分析。相关性的系统分析揭示了与潜在代谢失调相关的惊人数量的特异性改变(图2a)。这些观察可以分为两类。

首先，DNA高度甲基化似乎通过抑制某些代谢物降解途径来影响代谢物水平。例如，SLC25A20甲基化与长链酰基肉碱种类(例如，油酰基肉碱)的积累密切相关(图2b)。SLC25A20，也称为肉碱/酰基肉碱转位酶，使酰基肉碱穿过线粒体内膜进行脂肪酸氧化。SLC25A20高甲基化与显著的mRNA转录物减少相关(图2c)，这与具有14、16或18个碳的酰基链的酰基肉碱种类的水平显著升高相关(图2d-g)，但与具有更短或更长酰基链的其它酰基肉碱种类无关，这表明在这些细胞系中存在不寻常的特定脂肪酸分解代谢缺陷。

第二，DNA高度甲基化似乎通过限制生物合成途径的成分来调节代谢物水平。例如，脯氨酸水平降低与PYCR1的高甲基化有关，PYCR1编码将吡咯啉-5-羧酸盐转化为脯氨酸的酶(图2h，I)。此外，丙氨酸水平的降低与GPT2的高甲基化有关，GPT2通过转氨基作用合成丙氨酸(图2j，k)。这两种效应在造血细胞系中尤为明显。

综上所述，这些发现表明，这种资源为评估调节细胞内代谢物浓度的DNA甲基化的影响提供了一种公正的方法。

Fig. 2 | Systematic evaluations of metabolite associations with gene methylation patterns

代谢物依赖性关联分析 >>

长期以来，人们一直希望治疗癌症的代谢失调。为此，我们试图将代谢变化与DepMap CRISPR-Cas9基因敲除数据集揭示的癌症易感性联系起来，该数据集包含483个CCLE细胞系用约74000个靶向约17000个基因的sgRNAs文库筛选。CERES分数用于总结基因水平的依赖性（较小的值表示对基因敲除的敏感性更高），然后就代谢物变化询问每种基因水平的依赖性。这种无偏倚的代谢物依赖性关联分析表明，在癌细胞系中观察到的不同代谢表型与独特的基因依赖性配对，因此与潜在的治疗靶点配对（图3a）。在这里，我们着眼于前3,000个依赖基因（方法），并着重介绍与氧化还原平衡，氨基酸和脂质相关的新陈代谢实例。

首先，正如所料，氧化还原代谢物(包括谷胱甘肽、GSSG和NADP+)的异常积累(部分归因于KEAP1突变，见上文)与NFE2L2(NRF 2)敲除敏感性增加相关，NFE2L2是一种参与抗氧化反应的转录激活因子(图3b–d)。值得注意的是，最相关的依赖性是SLC33A1（图3b–d），这是一种乙酰辅酶A转运蛋白，其在氧化还原稳态中的作用目前未知。另一个例子，我们发现具有较低天冬酰胺水平的细胞更多地依赖于其合成酶（ASNS）（在下文进一步探讨）和EIF2AK4（GCN2，参与氨基酸饥饿反应）（图3e）。此外，我们还观察到一个有趣的关联，涉及两个不同的三酰基甘油（TAG）簇（图3a）。一个簇由多不饱和TAG种类（来自三个酰基链的至少四个碳-碳双键）组成，另一个簇由不饱和度较低的TAG种类组成，包括单不饱和脂肪酰基（MUFA）（图3a）为了将富含任一簇的癌细胞分类，我们将它们标记为多不饱和脂肪酰基高（PUFA^high，n = 315）或多不饱和脂肪酰基低（PUFA^low，n = 325），排除了脂类不饱和度差异不明显的细胞（图3f）。这种不饱和度差异还存在于其他脂质中，例如磷脂酰胆碱（图3g）和胆固醇酯（图3h）。我们询问这种独特的脂质利用模式是否可能与目标依赖性有关。通过比较CERES分数，我们发现PUFA^high细胞系对GPX4的敲除敏感（图3i），它介导过氧化的PUFA的解毒。相反，PUFA^low细胞系对合成MUFA的CTNNB1或SCD丢失敏感（图3i）。总之，这些无偏倚的关联分析表明，体外培养的癌细胞系具有显著的脂质组学差异，可以根据PUFA分类进行选择性靶向。

Fig. 3 | Systematic evaluations of metabolite-dependency associations

CCLE的表型分析 >>

如上述结果所示，天冬酰胺水平降低与天冬酰胺合成酶(ASNS)损失敏感性增加密切相关(图3e)。非必需氨基酸天冬酰胺由ASNS合成，但也可以直接从培养基中摄入。研究表明，当培养基天冬酰胺被限制时，ASNS敲除显著地阻碍了细胞增殖。假设某些具有ASNS启动子超甲基化的CCLE细胞系异常地具有较低的ASNS表达，即使存在其转录激活因子ATF4（图4a），我们假设固有的甲基化依赖性基因抑制可能是使用特定的营养剥夺。

为了探索这一点，我们使用了PRISM技术的一种变体，其中用24个核苷酸条形码标记的544个粘附的CCLE细胞系以混合形式生长(图4b)。混合细胞池在具有确定氨基酸浓度的特定培养基条件下培养，然后通过处理6天后收集的条形码的高通量测序来估计相对细胞生存力。这里，我们发现当混合细胞群在限制性天冬酰胺条件下生长时，ASNS异常低表达的细胞群被选择性地耗尽(图4c)。

与此同时，进行了PRISM实验，其中精氨酸和谷氨酰胺(也是非必需氨基酸)被设置为不同的浓度。类似地，我们发现ASS1和GLUL的低表达(受启动子区甲基化的影响)标志着细胞对精氨酸、谷氨酰胺供应减少更敏感(图4d，e)。值得注意的是，在谷氨酰胺依赖性的情况下，我们还观察到与增殖倍增率的强相关性。综上所述，这些例子表明，DNA高甲基化影响对养分利用率的依赖性，例如癌细胞系亚群中的天冬酰胺，精氨酸和谷氨酰胺营养缺陷型。

Fig. 4 | Revealing amino acid metabolism auxotrophs by pooled cancer cell line screens

天冬酰胺酶的治疗用途 >>

尽管跨细胞系的精氨酸和谷氨酰胺依赖性表现为分级反应，但ASNS固有表达较低的细胞系和非敏感细胞系之间对天冬酰胺耗竭的显著的差异(图4c)促使我们探索天冬酰胺酶在治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)之外的潜在治疗价值。

我们证实ASNS超甲基化的细胞也缺乏蛋白质表达(图5a-c)，并且在体外对天冬酰胺酶高度敏感(图5d)。 为了确定是否可以在体内复制这种依赖性，我们随后将7×10⁶个的2313287（ASNS高）或SNU719（ASNS低）细胞皮下植入了裸鼠的两个侧面。肿瘤体积达到100-200 mm³后，我们用腹膜内注射天冬酰胺酶（3,000 untis/ kg /injection，每周5次）或载体对照治疗小鼠，并在3周的时间内监测肿瘤的生长。

在这里，我们观察到SNU719肿瘤的生长显着下降，但2313287肿瘤则没有，体重减轻很小（图5e）。我们还表明，在这些异种移植物的植入和治疗过程中，ASNS的甲基化水平高且表达缺失（图5f）。这些数据还表明，ASNS免疫组织化学(IHC)可能应用于门冬酰胺酶试验患者的分层和选择。

为了根据来自人类肿瘤样本的数据确定相关患者群体，我们在《癌症基因组图谱》(TCGA)中检查了胃癌和肝癌中的DNA甲基化，并发现其与肿瘤样本中ASNS表达减少显著相关(图5g)。总的来说，这些结果表明，天冬酰胺酶可以抑制癌细胞系中特定亚群的生长，并且在体外和体内都丧失ASNS表达。

Fig. 5 | Therapeutic value of asparaginase in stomach and liver cancers

 CCLE犬尿氨酸代谢景观 >>

除了分析具有营养价值的代谢物，我们还探索了信号代谢物的模式，包括犬尿氨酸。犬尿氨酸由色氨酸分解代谢产生，可通过芳香烃受体(AHR)发挥免疫抑制作用，从而抑制效应性T细胞增殖并增强调节性T细胞生成。这些发现促进了针对犬尿氨酸途径的IDO1抑制剂与PD1阻断相结合的临床试验。在CCLE中，我们观察到多种癌症类型中细胞内犬尿氨酸的浓度范围跨越三个数量级（图6a）。我们发现，在细胞系的发现和验证组中，较高的细胞内犬尿氨酸水平与向培养基中的更多分泌强烈相关(图6b)。这些数据表明，细胞内犬尿氨酸浓度较高的细胞系也积极地将其分泌到细胞外空间。

接下来，我们通过将不同浓度的犬尿氨酸浓度应用于带标记并混合形式生长CCLE细胞系，探究犬尿氨酸水平是否对细胞增殖率有直接影响。在大多数细胞系中观察到弱至中度的生长降低，并且与内在合成能力无关，这表明犬尿氨酸在体外不能促进细胞增殖。

值得注意的是，吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）和色氨酸2，3-双加氧酶（TDO）都是催化色氨酸转化为N-甲酰基犬尿氨酸的酶，后者是犬尿氨酸的前体。通过将mRNA转录本(n= 18205)与犬尿氨酸水平相关联，我们发现IDO1、IDO2和TDO是与犬尿氨酸水平显著相关的热门(图6c)。

有趣的是，我们在具有高IDO1、IDO2或TDO mRNA水平的细胞系中观察到了丰富的胞内犬尿氨酸(图6d)。通过基于IDO (IDO1为主要形式)对TDO的表达对具有高水平犬尿氨酸的癌细胞系进行分类，我们发现大约三分之一的细胞系同时具有IDO1和TDO表达，其余的由IDO1或TDO驱动(图6e)。在TCGA的不同肿瘤样品中也观察到了这种不同的表达模式（图6f）。

这一发现表明，癌细胞可能使用一种酶或潜在地使用两种酶来产生犬尿氨酸。接下来，我们探究IDO1选择性抑制剂依帕妥司他在这些不同情况下是否能有效阻断犬尿氨酸的分泌。我们发现依帕卡司他完全抑制NCIH596（IDO1^high）中犬尿氨酸的分泌，导致IGR39（IDO1^high + TDO^high）中犬尿氨酸的分泌大量减少，但对JHH7（TDO^high）的影响很小（图6g）。

因此，这些将高犬尿氨酸与IDO1或TDO mRNA表达相关的数据表明，选择性IDO1抑制可能仅在这些肿瘤的一个亚组中起作用，并且可能进一步受到TDO介导的逃逸。最近，报道了在未选择的转移性黑素瘤患者中，依帕卡司他与抗PD1抗体派姆单抗联合使用的III期临床阴性数据。我们的数据提出了这样一种可能性，即选择产生犬尿氨酸的肿瘤增加的患者，同时了解哪些酶产生犬尿氨酸，可能对进一步开发IDO和TDO抑制剂至关重要。

Fig. 6 | The landscape of kynurenine metabolism in the CCLE

文章结论

癌症在组织学、潜在的遗传改变模式和代谢特征上是多样的。迄今为止，还没有对来自具有不同遗传背景的多个谱系的数百种模型癌细胞系进行系统的代谢组学分析。为了弥补这一差距，我们对928个癌细胞系中的225种代谢物进行了分析，并将这些数据与其他大规模分析数据集进行了交叉。

这种广度和深度允许以无偏见的方式探究各种代谢特征，并鉴定出具有相似模式的代谢物。除了基线代谢物水平揭示的多样性外，我们还用554个条形码细胞系的集合筛选研究了动态代谢网络中对扰动的不同增殖反应。总的来说，数据和分析表明，在未受干扰和受干扰的状态下，癌细胞系中都存在不同的代谢表型，并且这种表型对靶向代谢的治疗有直接影响。

在未来的大规模代谢组学分析工作中，应考虑并改善我们研究的一些局限性。首先，除了质量控制（QC）用途外，大多数配置的细胞系仅使用一个生物学样本。尽管已经实施了质量控制措施，并且多次分析证明了该数据集中的丰富信息，但是仍然存在来自多个来源的噪声，需要通过额外生物重复改善数据质量。 其次，我们希望获得更多的代谢物来产生关于更多生化途径的信息。第三，由于本研究的规模，我们无法使用动态测量方法，因此，我们只能看一下各种代谢物的稳态水平。最后，用于组织培养的培养基与体内环境仍然存在显着差异。因此，肿瘤样品的大规模代谢组学表征将是重要的下一步。

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