项目文章 | 华中农大罗利军团队水稻代谢组学抗旱机制突破

本篇由上海市农业生物基因中心和华中农业大学植物科学技术学院（通讯作者罗利军博士）团队在Frontiers in Plant Science发表的 “Transcriptomic and Metabolomic Studies Disclose Key Metabolism Pathways Contributing to Well-maintained Photosynthesis under the Drought and the Consequent Drought-Tolerance in Rice”的文章，通过GC-MS非靶向代谢组学分析和转录组学技术，发现两种代谢物在抗旱机制的重要作用，透彻地阐明了水稻耐旱性的分子基础。

与野生物种相比，农作物的耐旱性需要调动很多新陈代谢过程但是干旱期间的光合作用调节以及相关的转录和代谢之间联系仍然未知。在本研究中，作者使用了两个具有不同耐旱性的水稻品种（耐旱品种IRAT109和耐旱品种IAC1246）来探索长期干旱的转录和代谢应答。经研究发现在进行性干旱胁迫下，耐旱品种表现出较高的渗透调节和抗氧化能力，以及较高的相对光合作用速率，基于代谢组学的研究方法是筛选干旱候选基因的有效方法。

1.实验材料和分组

使用两个抗旱水稻品种（IRAT109：低耐旱性；IAC1246：高耐旱性）。

实验设计为单因素随机区组，分6个时间点采集叶片样品：（A）后分蘖期、（B）孕穗期、（C）孕穗期、（D）IRAT109抽穗期、（E）IAC1246抽穗期和（F）重新浇水。从土壤水分含量来看，将时间点A和B归为轻度干旱期（I），时间点C，D和E为重度干旱期（II），时间点F为补水期（III）。

图1 | 干旱处理期间监测的土壤水分含量和相关的方差系数

2.测量生理性状

相对含水量（RWC）、重量克分子渗透浓度、总抗氧化剂容量（AOC）、水稻收获后的生物量和籽粒产量、抗旱性系数（干旱胁迫田的谷物产量/水肥田的谷物产量）、光合作用速率；

3.转录组测序

4.定量表达基因和差异表达基因的鉴定

通过qPCR方法验证了测得的基因表达水平，并选择9个基因，包括已知的抗旱基因和几个候选基因进行验证。

5.基因本体和KEGG途径的富集分析以及通过Mapman进行的综合途径分析

6.GC-MS非靶向代谢组学分析

1.IRAT109和IAC1246耐旱性和相关生理特性

在干旱处理期间，土壤水含量在前12天（覆盖A和B时间点）保持在18.0％以上，然后降低到小于15.0％（从C到E时间点覆盖）（图1）。土壤含水量变化系数的平均值为6.96％（图1），表明土壤含水量均匀。

通过叶片相对含水量（RWC）、渗透压、总抗氧化剂容量（AOC）的差异可以看出（图2，表1）, 两个品种之间的耐旱性不同，与IAC1246相比，IRAT109的耐旱性要低得多（表1）。IAC1246的光合作用速率在干旱早期表达水平正常，而IRAT109的光合作用速率则显著降低（图3A，B）。在干旱条件下，IAC1246和IRAT109的光合作用速率均显著下降（图3A，B）。

图2 | 样品间耐旱性比较

在整个干旱期间，IAC1246的相对光合作用速率（干旱/ CK中的CO₂同化率）远高于IRAT109（图3C）。在干旱期间，两个品种的相对气孔导度（干旱中的气孔导度/ CK中的气孔导度）几乎相似（IRAT109中稍高）（图3F）。该结果表明IAC1246中较高的相对光合作用速率与气孔导度无关。

图3 | 在干旱时期测得的叶片气体交换参数

2. 在IRAT109和IAC1246识别的差异表达基因（DEG）

在干旱时期，耐旱品种IAC1246的DEGs（范围从548到766）比易旱品种IRAT109（范围从916到1700）少（表2）。然而重新浇水后，与IRAT109相比，IAC1246中的DEG数量要高得多(表2）。作者仅在六个时间点（表2）检测到IRAT109和IAC1246之间有限数量的共有DEG。基于总DEG的Log₂FC进行的聚类分析支持通过土壤-水分将干旱过程分为三个时期，在这个时期中，时间点C，D和E聚集在一起。有趣的是，IAC1246中所有DEG的平均绝对FC值在所有三个时期均显著高于IRAT109，通过qPCR，验证基因的FPKM值与其相对表达高度相关。

表2 | 在六个时间点下两个品种IRAT109和IAC1246检测到上调和下调的DEG数量

3. 特定材料和特定时期的DEG及KEGG / GO富集

在IRAT109和IAC1246中作者分别确定了4059和2677个DEG（图4A，B）。对于IRAT109，在时期I，II和III分别发现了1750、2710和573个DEG，其中大多数是特定于时期的（图4A）。对于IAC1246，在时段I，II和III分别找到了1081、1506和797个DEG，其中大多数也是特定于时段的（图4B）。此外当比较同一时期两个品种的DEG时，大多数DEG是特定品种的（图4C-E）。

图4 | 不同干旱时期之间维恩图

KEGG途径的富集还显示了明显的时期和品种特异性模式（图5）。糖和氨基酸代谢的途径优先在IRAT109富集。但是在IAC1246中，与抗氧化活性相关的途径在干旱期间富集（图5）。

值得注意的是，作者发现II期在IAC1246中富集的几种KEGG途径在III期的IRAT109中更加丰富（图5）。与KEGG途径的富集相似，富集的GO项表现出明显的品种和时期特异性结果，表明在这两个品种中激活了不同的分子机制。例如“水跨膜转运蛋白活性”和“水通道活性”在IRAT109中高度独特地富集，而抗氧化剂相关的GO项在IAC1246中独特地富集。

图5 | 干旱时期富集的KEGG途径热图

根据Mapman结果，IRAT109和IAC1246之间最明显的差异是DEGs的上调，这些DEGs参与IAC1246中抗坏血酸和谷胱甘肽的光反应和代谢。但是相同的DEG在IRAT109（图6）中被下调，尤其是在时间点A，B和F。此外在IRAT109检测到更多参与OPP循环以及淀粉和蔗糖代谢的上调DEG（图6）。

图6 | 细胞代谢途径概述

4.在IRAT109和IAC1246中渗透压、AOC和光合作用相关DEG的调节

在IRAT109中，作者发现1200 个DEG（占总DEG的29.6％）和268 个DEG（占总DEG的6.6％）分别与渗透压和AOC显著相关。在IAC1246中，发现772个（占总DEG的28.8％）和293个（占总DEG的10.9％）DEG分别与渗透压和AOC显著相关，其中60个与渗透压和AOC都相关。

作者发现IRAT109和IAC1246共享了241个常见的渗透压相关的DEG和12个AOC相关的DEG（图7A，B）。尽管这些常见的渗透压相关DEG（图7A）和AOC相关DEG（图7B）的一般调节模式在IRAT109和IAC1246中相似，但作者发现它们在IAC1246有更高的调节幅度（图7A，B）。

由于Mapman结果表明两个品种之间光反应的普遍差异，作者特别关注了干旱期间光合作用相关基因的调控。在IRAT109和IAC1246中总共48和64个与光合作用相关的基因表达有差异。与光合作用相关的DEG在IRAT109和IAC1246之间表现出不同的调节模式，尤其是在I期。在IAC1246中许多DEG基因上调，而在IRAT109中被下调（图7C）。与光合作用相关的DEG相比，IRAT109和IAC1246中的叶绿体基因表现出相似的调控模式（图7D），这提供了另外的证据表明两个品种之间光合作用的效率不同。

图7 | DEG变化

5.干旱期间在IRAT109和IAC1246中检测到的差异代谢物

作者分别在IRAT109和IAC1246中检测到185和130种代谢物，其中两个品种共有101种。在IRAT109和IAC1246中分别鉴定出总共69和47个差异代谢物（图8A）。在IRAT109中，作者发现I和II期分别在干旱胁迫和水分充足条件下分别有26种和55种代谢物显著不同（图8A）。在IAC1246中，分别在I和II期的干旱胁迫和灌溉充足的条件下，有24种和37种代谢物具有显著差异（图8A表S9）。此外这两个水稻品种之间几乎没有差异代谢物（图8A）。

根据这些不同的代谢产物，通过PCA分析对IRAT109进行分离，从干旱和水源充足的条件中分离样品（图8B）。但是对于IAC1246，这仅适用于灌溉条件良好的时间点C至E的干旱胁迫样品（图8C）。

图8 | 干旱时期和品种之间差异代谢物的维恩图

在IAC1246和IRAT109中均可检测到的45种代谢物被确定为IAC1246和/或IRAT109中的差异代谢物（图9）。这些代谢物中的许多代表IAC1246和IRAT109之间的不同时间模式（图9）。例如在干旱时期I，IAC1246中阿魏酸和4-羟基肉桂酸的含量大大增加，而同期IRAT109中，阿魏酸和4-羟基肉桂酸的含量仅略有增加（图9）。在时间点E，许多不同的代谢产物显著上调，包括腐胺、5-甲氧基色胺、丙二酸、枯二酸、蔗糖、二羟基丙酮、3-羟基丁酸、氨基丙二酸、6-磷酸葡萄糖和硫氰酸苄酯（图9）。但是作者发现IRAT109干旱期间木糖醇和硬脂酸的含量增加，而IAC1246没有明显变化（图9）。

图9 | 差异倍数变化的热图

6.与IRAT109和IAC1246中的渗透压、AOC和DEG相关的差异代谢物

在IRAT109中，作者发现了17种与渗透压显著相关的差异代谢物和4种与AOC显著相关的代谢物。在IAC1246中，作者发现了10种与渗透压显著相关的代谢物和一种与AOC显著相关的代谢物。在这些和渗透压与AOC相关的代谢产物中，在IRAT109和IAC1246中均检测到10种代谢产物。

IAC1246中35–1013个DEG与31种差异代谢产物显著相关，而IRAT109中47–1559个DEG与22种差异代谢产物显著相关。作者特别注意到4-羟基肉桂酸和阿魏酸，因为在早期干旱时期IAC1246中它们被上调。IAC1246和IRAT109中有448和658个与4-羟基肉桂酸相关的DEG，分别包括0和17个与AOC相关的，347和157个渗透浓度相关的DEG，以及4和2个与光合作用相关的DEG。IAC1246和IRAT109中的1013和301 个DEG与阿魏酸相关，分别包括234和29个与AOC相关，599和17个与渗透压相关以及5和0个与光合作用相关的DEG。一些与4-羟基肉桂酸和阿魏酸相关的DEG与它们自己的代谢途径相关。

7.基于代谢物的耐旱候选DEG的研究方法

在IRAT109和IAC1246中检测到的10种与渗透压或AOC显著相关的差异代谢物，有六种（D-阿拉伯糖醇，乳酸酰胺，帕拉金糖醇，4-羟基肉桂酸，氨基丙二酸和阿魏酸）表现出IAC1246和IRAT109不同的调节规律（图9）。特别是在IAC1246和IRAT109中，4-羟基肉桂酸和阿魏酸均被确定为差异代谢物。与光合作用相关的DEG的上调一致，它们在IAC1246的早期干旱期间表现出明显的上调。另外，许多渗透压和AOC相关的DEG与这些以及光合作用相关的DEG相关。这两种代谢物涉及四个KEGG途径（泛醌和其他萜类醌生物合成，酪氨酸代谢，苯丙氨酸代谢和苯丙烷类生物合成），其转录组数据也对其进行了补充（图5，表3）。十二种渗透压和/或与AOC相关的DEG参与了这四个途径（表3）。如所预期的，这些DEG也与两种代谢物相关。因此这些DEGs是改善耐旱性的有价值的潜在目标，因为它们可能调节4-羟基肉桂酸和阿魏酸代谢。

表3 |参与KEGG途径的候选DEG与4-羟基肉桂酸和阿魏酸相关

1.两种栽培品种和试验设计的对比抗旱性揭示了抗旱性的潜在分子基础

通过转录组和代谢组学分析，为研究耐旱性的潜在分子基础提供了很好的机会。

2.干旱易感和耐旱品种的渗透调节和抗氧化能力的不同转录组和代谢组学基础

本研究证实了两个水稻品种的耐旱性分子基础不同，尤其是在渗透调节方面。IRAT109倾向于激活糖代谢的途径，而IAC1246则倾向于脂质代谢的途径，以适应干旱胁迫期间的渗透调节。

IAC1246的抗氧化能力相关DEG几乎是IRAT109的两倍。IAC1246似乎更多地依赖抗氧化剂，并且在该品种中许多生物过程以及黄酮和黄酮醇的生物合成更多。结果表明，独特且高度调节的抗氧化剂体系可以作为IAC1246耐旱性提高的合理解释。

3.维护良好的光合作用有助于提高耐旱性

在本研究报道中，耐旱性较高的水稻品种在干旱条件下具有较高的生物量积累和籽粒产量。结果表明耐旱品种的光合作用水平提高或保持良好，归因于该耐性品种改良的渗透调节和抗氧化剂。

4.基于代谢物的候选基因在水稻中的耐旱性

在这项研究中，作者研究了两个水稻品种的代谢途径，特别是那些与光合作用相关DEG的表达增强有关的代谢产物。作者以代谢物为中心的方法来挖掘候选基因，参与这两个关键代谢产物代谢途径的DEGs将成为有希望改善水稻耐旱性的靶向基因。

在这项研究中作者评估了两种不同耐旱性的水稻品种的转录组学和代谢组学差异。它们代表了不同的渗透调节作用和抗氧化能力，从而导致逐步干旱期间光合作用的不同调节。代谢物在通过渗透调节和/或抗氧化剂机制保护脱水下的光合作用中起着至关重要的作用。因此代谢组学方法是探索干旱候选基因的有效方法，应进一步研究代谢物与转录物对干旱胁迫的反应，以发现更多有用的代谢物、途径和基因。

这篇文章发表时间较早，但却是一篇非常典型的转录组-代谢组联合分析的文章。作者利用GC-MS非靶向代谢组学的结果，不仅找到与渗透度和总抗氧化剂容量相关的两个代谢物，还找到了与之密切相关的差异基因群，而且合理解释了耐旱性不同的两种水稻的分子机制差异，该研究的实验设计和研究思路都很清晰，可作为农业方向研究人员的参考。

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嫣然  撰文

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