13_同位素标记化合物的谱图准确度定量分析

2026-04-28 11:05:23, 绿绵科技北京绿绵科技有限公司

1 引言

同位素标记化合物及相关实验在研究新化学实体的吸收、分布、代谢与排泄（ADME）性质，以及代谢流分析、定量生物分析中发挥关键作用。标记化合物通常含有一定比例的未标记化合物，其相对含量会在后续分析与结果报道中引入系统误差。

目前常用的同位素标记化合物定量方法包括：带放射性溶液计数的高效液相色谱 - 紫外检测（HPLC-UV）、核磁共振（NMR）以及质谱法（MS）。

利用质谱对标记同位素定量存在显著挑战：

1) 标记同位素通常难以实现色谱分离；

2) 不同标记化合物的 A、A+1……A+n 峰与未标记峰彼此严重重叠，多数高分辨质谱无法在谱学上完全分辨；

3) 含高天然丰度重同位素的杂原子（如 Cl、S、Br）会进一步加剧峰重叠。

尽管已有多种谱图重叠校正方案被报道，但即便对于高浓度混合物（如标记 / 未标记比例 50:50），定量误差仍可达 ±10% 甚至更高，导致质谱对 5%–10% 低比例混合物的可靠定量几乎无法实现。

谱图准确度（Spectral Accuracy）是一项成熟技术，通过在轮廓（原始）模式下直接比较实测与理论同位素分布，避免质心化、非线性滤波带来的数据缩减与系统误差。该概念已用于质谱元素组成解析，减少常规精准质量搜索产生的候选分子式数量。

实测质谱信号受仪器特定峰形影响，而峰形无统一数学函数、随仪器与时间变化。因此需要用已知分子式标准品进行峰形校准，将实测谱校准为具有明确数学峰形（高斯 / 洛伦兹）的谱图，使校准后实测谱与理论计算谱可精准比较，大幅减少未知物鉴定的候选分子式。

对于未分离的标记 / 未标记混合物，总质谱响应可表示为各组分响应的线性组合，即多元线性回归（MLR）模型：

• r：混合物在 n 个质量点的质谱响应（强度）向量；

• K：p 个纯组分（标记 / 未标记）在 n 个质量点的响应矩阵

• c：回归系数向量（与样品中 p 个组分浓度成正比）

• e：谱图误差向量（随机噪声 + 系统偏差）

组分浓度向量可通过经典最小二乘法求解：

若所有组分电离效率一致，回归系数 c 可归一化为相对浓度。

混合物中重叠组分的精准定量依赖两点：

1) 上述线性加和模型的有效性；

2) 对样品中所有纯组分质谱响应的精准预知，核心是真实仪器峰形。

与光谱学不同，质谱理论同位素分布可基于分子式精准计算，无需纯品实测。理论轮廓模式质谱响应可表示为：

• k₀：理论同位素分布

• d：质谱峰形函数（高斯 / 洛伦兹）

但假设峰形 d 与实测峰形存在偏差，会导致 5%–10% 以上的系统误差。因此峰形校准至关重要，可使校准后实测谱与理论谱峰形一致，实现高精准拟合与多组分混合物分析。

谱图拟合误差可用相对谱误差（e）表示，(1−e)×100% 即为谱图准确度，100% 代表无噪声、无误差的完美拟合。

2 实验部分

2.1 化学品

使用两种市售同位素标记化合物及其未标记形式。一种含氯和硫，为稳定氘标记物氢氯噻嗪 - 3,3-d₂（HCT-d₂）；另一种含氯，为多位点（均匀）¹⁴C 标记物双氯芬酸钠。两种化合物的未标记形式均购自 Sigma-Aldrich。溶剂为市售 HPLC-MS 级溶剂。标记化合物的化学结构如图 1 所示。

2.2 单独储备液与工作标准液

分别配制未标记 / 标记 HCT 储备液（1 mg/mL），逐级稀释为 0.1、0.01、0.001 mg/mL。将未标记与标记 HCT 按体积混合，得到 10 个梯度标准溶液（0%~100% 标记物）。双氯芬酸样品采用相同配制方式，不校正标记纯度。

2.3 仪器

HCT 样品在Agilent 6120B单四极杆质谱（系统1 ）上分析，双氯芬酸样品在Waters Xevo TQs三重四极杆质谱（系统 2）上分析。

2.4 软件

使用MassWorks进行质谱峰形校准与 MLR 混合物分析，使用 MATLAB 进行额外的数据绘图与处理。

2.5 实验方案

选用含 Cl/S、同位素分布复杂、峰重叠严重的 HCT 与双氯芬酸作为模型体系，配制 10 组梯度混合物，每组重复进样 3 次。对色谱峰轮廓模式谱图平均化提升信噪比，用未标记标准品进行峰形校准，将理论计算谱通过 MLR 拟合至校准后混合物谱，计算相对浓度，并与理论值比较验证准确度与精密度。

3 结果与讨论

最初使用 Thermo LTQ/Orbitrap 进行测试。研究表明，在这类仪器上获得最佳谱图准确度（即准确同位素轮廓），存在一个最优分辨率，通常在分辨率范围的中低段，例如该 LTQ/Orbitrap 在 7500 左右。对于仅含 C/H/N/O/F 的部分初始测试化合物，谱图准确度可达 99.0% 及以上，表现优异。

然而对于同时含硫和氯的未标记 HCT 标准品，谱图准确度显著下降至 97%。进一步实验发现，未标记与标记 HCT 50:50 混合物的谱图准确度降至更低的 92%，对应高达 8% 的谱图误差。据认为，该误差主要源于 HCT 中高天然丰度的 ³⁷Cl（A+2）与 HCT-d₂的单同位素峰（A）之间的离子 - 离子相互作用，造成 A+2 同位素簇内的空间电荷效应。

在同时含高浓度 HCT 与 HCT-d₂的 50:50 混合物中，两个重要的同量异位素在 Orbitrap 内距离极近，导致谱图准确度差，进而定量效果不佳。自然，这些误差会传递到 MLR 混合物分析中，导致浓度c的误差最高可达 ±10%。相关文献指出可通过自动增益控制（AGC）控制目标离子数来改善，这一主题可作为另一篇文章的深入研究内容，包括与质心数据处理、未做峰形校准的轮廓模式质谱数据的对比。

尽管如此，我们仍决定在更普及的四极杆质谱仪上完成关键测试与验证实验，因为这类仪器具有公认的宽线性动态范围，有助于获得高谱图准确度。虽然这些仪器只能达到单位质量分辨率，但本文介绍的质谱峰形校准与 MLR 谱图拟合方法并不要求更高分辨的测量。

HCT 样品在大学通用质谱实验室的 LC/MS 系统 1（Agilent HPLC + 单四极杆 MSD）上测定。使用一针未标记标准品（样品 10）进行峰形校准，然后应用于所有其他进样。采用未标记 HCT 与 HCT-d₂的理论计算质谱进行 MLR 混合物分析，得到其相对浓度。MLR 谱图拟合范围设为 HCT 的 [M−H]⁻离子单同位素峰（m/z 296）相对−1 至 + 5.5 m/z。

考虑到标记化学中经常出现但未被充分重视的标记不完全或过度取代，将同样的 MLR 混合物分析应用于纯标记标准品（样品 1），三次重复平均后，其中含 2.4% 未标记 HCT、可忽略的 0.3% HCT-d1 以及更低比例的 HCT-d3。值得欣慰的是，这一结果与厂家基于 NMR 测定的 98.2% 氘代率估算值一致。

计算得到的纯标记标准品（样品 1）中残留未标记 HCT 的平均浓度，用于校正所有体积配制混合物的计算浓度，得到其期望浓度以用于比较（表 4）。由于未发现明显含量的 HCT-d1，在后续所有 MLR 分析中，将其从K矩阵的可能组分中剔除。

表 4 汇总了每个混合物中 HCT-d₂与 HCT 的 MLR 分析结果，包括相对浓度、平均浓度误差与三次重复的标准偏差。平均浓度误差（反映测量偏差或系统误差）均 < 0.6%，小于或接近于标准偏差（均 < 1.0%）。系统误差整体小于随机波动这一事实，为整个方法学提供了信心。

表4：HCT 标准品系列的多元线性回归 (MLR) 混合组分分析结果

图 2 为 HCT-d₂实测浓度与期望浓度的关系图，包含每个样品的重复测量。对数据进行线性最小二乘拟合，决定系数（R²）高达 0.9997，强制过原点时预测标准误（SEP）为 0.53%。不强制过原点时，截距为 0.05%（接近 0），斜率为 1.0008（接近 1），定量表明整个测量过程的准确度。

图2：HCT-d₂实测浓度与理论浓度的关系图

图 3 为三个不同样品的 MLR 拟合理论混合物质谱（黑色）与峰形校准后实测质谱（红色）的叠加图。所有混合物的谱图准确度约为 98% 至 99% 以上，从图形与诊断角度证实，在存在随机测量误差的情况下，质谱峰形校准过程与 MLR 模型能够恰当反映真实的质谱测量。总体而言，这些结果表明，未知样品的浓度测量误差约为 0.5%，且与相对浓度水平无关。

图3：理论值与实际的 HCT-d2 值对比。标准品（样本 #10）、标记标准品（样本 #1）以及未标记标准品与标记标准品各占 50% 的混合物（样本 #9）

双氯芬酸样品在通过放射性标记化合物使用认证的实验室 LC/MS 系统 2（Waters Acquity UPLC + Waters Xevo TQ-s LC-MS/MS）上测定。¹⁴C 标记双氯芬酸在氯代芳香环上引入 ¹⁴C，反应可将标记均匀引入环上任意位置，数量从 0 个到全部 6 个环位点。这使得混合物分析变得复杂，需要对未标记双氯芬酸与含 1–6 个标记的 ¹⁴C 标记双氯芬酸进行七组分 MLR 拟合。注意 LC-MS/MS 仪器仅通过扫描 Q3、Q1 全过离子的方式作为单四极杆使用。质子化加合物 [M+H]⁺与钠加合物 [M+Na]⁺均容易观察到。

对两种离子的初步峰形校准表明，[M+Na]⁺离子在校准时具有更高的谱图准确度，可能是因为在包含所有重要同位素簇所需的更宽质量范围内化学噪声更低，因此用于后续分析。然而该质荷比区域存在大量背景离子信号，通过从钠加合物双氯芬酸峰中减去相邻保留时间窗口内的平均背景谱进行校正。使用一针未标记双氯芬酸标准品（样品 10）得到峰形校准，并应用于其余进样样品。

MLR 混合物分析在未标记双氯芬酸 [M+Na]⁺离子单同位素峰（m/z 318）相对−1.5 至 + 14.5 m/z 的谱图范围内进行。由纯标记标准品（样品 1）计算得到的未标记双氯芬酸平均浓度，用于校正所有混合物的计算浓度，得到期望浓度以用于比较。值得注意的是，纯标记标准品（样品 1）中未标记形式的含量计算为 62.03%，其余分布在 1–6 个 ¹⁴C 标记的各种形式中。

基于每个分子测得的总 ¹⁴C 数，计算得到标记标准液的放射性比活度（SA）为 66.64 mCi/mmol，厂家值为 62.7 mCi/mmol。实测比活度可直接计算：只需将所有 1–6 个标记物种的 ¹⁴C 数量按各自相对浓度加权求和，再乘以已知的单个 ¹⁴C 最大比活度（62.4 mCi/mmol）。

该方法的一个优点是与测得浓度或任何杂质无关（不同于 LC/UV 标准曲线法），也不需要放射性检测器，因为它通过质谱直接测量每个分子的 ¹⁴C 原子数，即使标记分布很宽 —— 这是早期研究遇到的难题。

表5：双氯芬酸钠标准品系列的多元线性回归 (MLR) 混合组分分析结果

表 5 汇总了每个混合物中标记与未标记浓度的 MLR 混合物分析结果，以及平均浓度误差与标准偏差。图 4 为标记双氯芬酸预测浓度与计算浓度的关系图，包含每个浓度下的重复测量；图 5 为未标记双氯芬酸的对应图。对数据进行线性最小二乘拟合，标记物决定系数（R²）为 0.9989，未标记物为 0.9998。预测标准误（SEP）标记物为 1.98%，未标记物为 1.12%。

图4：[14C]标记双氯芬酸的预测值与实测值

图5：未标记双氯芬酸的预测值与实测值

图 6 为纯标记标准品（样品 1）与未标记标准品（样品 10）的 MLR 拟合理论质谱（黑色）与峰形校准后实测质谱（红色）的叠加图。所有混合物的谱图准确度约为 98% 至 > 99%。SEP 比简单二组分 HCT 混合物大 2–4 倍，这符合预期，原因在于：

1）七组分混合物建模复杂度增加，因K矩阵条件数导致误差放大效应逐渐增加；

2）尽管已进行背景校正，用于包含所有重要同位素的更宽质荷比范围使模型更易受谱图干扰影响。

图6：从上到下依次为：标记标准（样品#1）和未标记标准（双氯芬酸，样品#10）的校准（红色）和 MLR 修正后的质谱图。

多组分建模还使我们能够详细了解标记芳香环上 ¹⁴C 掺入的精确分布，为标记化学提供有价值的反馈，这是放射性计数方法无法实现的。图 7 展示了 0–6 个 ¹⁴C 标记物种对校准后实测质谱的贡献，以及显示各形式相对含量的柱状图。

图7：叠加图展示了0–6 个[14C] 掺入条件下经多元线性回归（MLR）拟合得到的质谱光谱贡献值、线形校准后的实测混合样品质谱图（红色曲线），同时附带简易柱状图，用以呈现标记标准品（1 号样品）各同位素形态的相对含量。

如前所述，我们在分析中假设标记与未标记化合物的电离效率相同。这在定量质谱中是一个颇具挑战的问题，因为化合物结构与基质效应会显著影响电离效率。幸运的是，标记化合物是公认的 “信号比校准” 内标首选。为避免或最小化质谱重叠或干扰，通常要求标记内标与未标记化合物质量相差至少 3 Da。

使用 MLR 混合物定量时，这一要求可被完全取消或至少大幅放宽，这一潜在优势可拓宽或开辟新的标记应用场景 —— 标记化合物本身甚至可以是含有不同标记数分布的混合物。

谱图准确度 MLR 方法的另一个优点是，将拟合优度以谱图准确度指标返回。这提供了一个有价值的诊断工具，为估计的浓度或分布增加可信度。常见问题如检测器饱和、背景或化学噪声、或存在未纳入K矩阵的未分离化合物，都会被检测到并表现为谱图准确度的显著下降。

总体而言，使用质谱定量标记化合物具有诸多优势：灵敏度高、线性动态范围宽（尤其是四极杆系统）、在现代实验室中普及、适用于绝大多数有机化合物，不受原子类型影响（不同于 NMR），也不受标记类型（稳定或放射性）限制。

最后，MLR 混合物模型的通用性使其可直接扩展到更复杂的应用，例如掺入数量可达数十个甚至更多的场景，如 ¹³C 稳定同位素标记有机物的代谢流分析，或肽、蛋白质等生物大分子的氢 / 氘交换（HDX）研究。可以想见，该方法适用于同一实验中涉及多种元素标记的研究，如定量蛋白质组学中的 ¹⁸O 与 ¹⁵N 双标记。同样的建模与混合物分析技术也可应用于同位素标记之外的其他类型化合物修饰，如生物制药杂质的脱酰胺、脱氨分析。

4 结论

文章中展示了一种用于复杂标记混合物质谱定量的新方法，对于标记与未标记化合物组成的简单二组分混合物，可实现接近 0.5% 水平的准确定量。该方法依赖于在原始（轮廓）模式下获取高质量、高谱图准确度的质谱数据，并进行严谨的质谱峰形校准。

虽然适用于单位质量分辨率与更高分辨率质谱，但在更普及的传统四极杆质谱仪上可获得最佳结果，这类仪器以宽线性动态范围与高谱图准确度著称。该方法操作简便，并提供易用的谱图拟合诊断指标，为定量结果提供可信度。混合物分析模型的通用性可轻松扩展到其他分子修饰，涵盖更多同种或不同类型标记，甚至可在无同位素标记的情况下使用。

关于MassWorks 软件

MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。