15_同位素谱图准确度对未知物分子式鉴定的重要性

2026-05-18 15:19:29, 绿绵科技北京绿绵科技有限公司

1. 质谱上的同位素谱图准确度

质谱上的未知物分子式的鉴定，不只是简单通过高精度的质量测定来确定分子式，在实际的分析中，无论是TOF，还是Orbitrap，通过精确质量计算出来的候选分子式都很难是唯一一个，除非该分子式的分子量很小，比如小于200且元素组成种类简单。

质谱图除了质量信息外，还包含由化合物中各种同位素的自然丰度（Natural Abundances）产生的峰强度信息。这种同位素信息可用于排除那些虽然质量匹配良好，但与观察到的同位素模式（Isotope Pattern）不一致的元素组成。长期以来，同位素峰（M、M+1、M+2……）相对强度的简单测量被认为是减少含溴、氯或硫化合物可能元素组成的有力补充指标，因为这些元素具有独特的同位素模式。然而，对于碳、氢、氮和氧产生的细微同位素差异，需要更复杂的计算方法才能有效解析元素组成。

理论研究证实，结合同位素信息后，可以轻松排除掉95%以上的错误候选化学式。 例如，一个质量在615.324 Da附近的分子，单凭5 ppm的质量精度会找到370个可能化学式；而加上5%的同位素丰度误差过滤后，候选者骤减至12个。这无疑为后续的结构鉴定工作扫清了绝大部分障碍。

图1：M+1 和 M+2 离子的同位素丰度可用于筛选分子式候选物。此示例展示了硅化山梨醇的同位素丰度模式。红色圆圈表示包含正确目标的 5% 区域。如果质谱仪在同位素丰度方面存在 5% 的误差（均方根误差），则所有其他分子式均可排除。（图片来源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）

同位素信息利用的三类方法

根据同位素信息的处理方法，现有公开方法可分为三类：

① 利用质谱质心数据（Mass Spectral Centroid Data）：即小分子通常 2 至 5 个主要同位素的有限列表。这类方法包括Grange及其同事的早期研究、通过 MassLynx 软件（沃特世公司）提供的商用工具 iFIT，以及Zweigenbaum的专利方法（利用主要同位素峰的同位素丰度和质量亏损）、Amirav的方法（将同位素丰度与超声分子束或电子电离相结合）。

② 利用轮廓质谱数据（Profile Mass Spectral Data）：不进行质心化，直接利用同位素模式的独特性和理论可预测性（即使单个同位素和同量异位素未被完全分辨）。包括布鲁克道尔顿（Bruker Daltonics）软件中的 SigmaFit 方法、Fernandez-de-Cossio等人的独立方法，但存在峰形函数假设导致的误差。

③ 质谱校准后利用轮廓数据：先进行包括峰形函数在内的质谱校准，再通过矩阵计算方法计算谱图准确度和谱图误差，保留所有同位素精细结构信息，避免质心化和峰形假设的缺陷。这一方法由美国Cerno Bioscience公司提出，被应用在MassWorks软件中，定义为谱图准确度（Spectral Accuracy, SA%）以反应质谱仪能真实测量离子同位素分布的能力。

谱图准确度对分子式鉴定准确度的优势在近些年的实践中已经被广泛证明，下文我们将用两个实例来展示谱图准确度在实际分析中发挥的重要作用。

2. 单位质量GC/MS和LC/MS上的谱图准确度与分子式鉴定

以利血平样品为例，在安捷伦四极杆LC/MS上测定，质量校正标样使用安捷伦调谐液，数据导入MassWorks软件中进行精确质量处理，M+H加合离子的实际测定的精确质量为609.2381，在10mDa的质量偏差范围内，选取元素组成C/HO/N进行CLIPS分子式检索及同位素谱图准确度分析，共得到37个分子式（见图2）。

图2：利血平样品的候选分子式和同位素谱图准确度结果

在这37个分子式中，正确的分子式排序为第1位，C33H41N2O9。第1和2个分子式的谱图准确度非常接近，偏差仅为0.07%，从完全未知物的角度来说，我们不能轻易下结论第1和2个分子式到底是哪个正确的，但从第3个开始谱图准确度下降幅度增大，我们可以直接排除掉，排除率94.6%。

图3显示了排序1、2、3位分子式的理论质谱图与样品校正质谱图的重叠，可以清晰地看到第3个分子式的理论图与校正图的在A+2处存在明显的拟合误差。

图3：利血平候选分子式前3位的理论谱图（黑色）与校正谱图（红色）的重叠对比

图4为客户寄送的盲样GC/MS数据，精确质量校正标样采用PFTBA调谐液，经MassWorks软件精确质量校正后，M+分子离子峰的测定精确质量为440.3964，在10mDa的质量偏差内，选取C/H/O/N元素检索分子式，如图所示共得到9个分子式。第1个分子式C31H52O的谱图准确度为99.18%，第2个分子式C28H28N4的谱图准确度为98.72%。

图4：客户盲样测试样品的GC/MS精确质量测定和分子式分析结果

图5显示了前3个分子式的理论质谱图和校正质谱图的重叠，可以清晰看到第2个分子式在A+1处的明显比样品图谱丰度低，而第3个分子式在A+1、A+2处均存在明显的拟合偏差，因此我们可以确定第1个分子式为正确的分子式，与客户最后公布的分子式结果一致。

图5：前3个分子式的理论质谱图与样品校正谱图的重叠

3. 高分辨MS上的谱图准确度与分子式鉴定

图6为ThermoFisher高分辨质谱Q-Exactive的样品测试结果，MS实测M+H离子的精确质量为369.1425，选取C/H/O/N/F/P/S/Si共八种元素做分子式的sLIPS search的同位素谱图准确度分析，在5ppm的质量偏差内，共有219个候选分子式。

图6：Q-Exactive高分辨质谱上的盲样分析结果

排名第1位的分子式C21H22O4P的谱图准确度99.56%，第2个分子式C20H18N2O4F的为98.95%，第三个分子式C23H17F4的为98.06%，而正确的分子式即为第1位的分子式。

从效果上看，谱图准确度对该化合物的分子式鉴定效果很明显，由于第1和第2个分子式的谱图准确度已经呈现了0.5%的差异，从经验上看已经可以从第二个分子式开始我们就可以全部排除掉，即使考虑到Q-Exactive在高分辨率模式下的同位素失真，我们将谱图准确度降幅增大到1%，那我们从第3个分子式开始也可以完全排除掉。这对于Q-Exactive上的完全未知物的分子式鉴定来说，意义重大，因为复杂的元素组成的候选分子式的数量可能会很庞大，但是谱图准确度可以将正确的分子式锁定在前几位，甚至是第1位。

4. 结论

MassWorks的同位素谱图准确度评价对于未知物的分子式鉴定能起到非常重要的作用，无论是低分辨质谱，还是高分辨质谱，它都能帮助我们缩小精确质量生成的候选分子式的考察范围，让我们可以将分子式锁定在众多候选的前列，甚至是第1位，大大降低了我们对未知物元素组成鉴定的难度。

它对于低分辨质谱来说完全是质的提升，因为它可以在没有高分辨MS的情况，直接在现有GC/MS和LC/MS就能实现几乎能媲美高分辨质谱的分子式鉴定效果，这对于低分辨质谱使用人员而言是一种非常便利的工具。

关于MassWorks 软件

MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。