HPLC方法开发与制备方法放大：以大麻二酚（CBD）纯化为例

2026-08-06 17:46:08, 绿绵科技北京绿绵科技有限公司

天然来源化合物的纯化可采用多种技术，包括单柱、多柱液相色谱法。但由于提取物基质成分复杂，开发高效、快速、低成本的天然产物纯化方法是一项极具难度的工作。与蒸馏等传统纯化工艺相比，制备色谱能耗更低、水与有机溶剂消耗量更少，同时产物收率更高。

本应用案例建立了从富大麻二酚大麻提取物中批量纯化 CBD 的工艺流程。

1. 引言

液相色谱可分为分析型与制备型两类，二者设计目标截然不同：分析型高效液相色谱（HPLC）用于分离混合物中各组分，实现物质定性与定量；制备型 HPLC 则用于单种或多种目标物质的分离提纯。

色谱纯化通常采用批量进样模式。标准开发流程为：先在分析型色谱柱上完成方法开发，再放大至制备级工艺。操作流程如下：

1）采用全梯度扫描，获取样品中各组分保留行为基础数据；

2）针对目标物出峰区间设计平缓线性聚焦梯度，优化目标峰分离度；

3）开展进样体积 / 上样质量过载试验，确定色谱柱最大承载量；

4）等比例放大色谱柱内径，同步保证分离度等关键分离参数稳定。

色谱方法放大计算必须精准，否则制备级分离无法复刻分析级的分离效果。色谱分离放大涉及大量相互关联变量，整体流程较为复杂；最简便的线性放大方案，要求色谱填料化学性质、柱长、填料粒径完全一致，仅改变色谱柱内径。

2. 样品处理

实验样品为乙醇基大麻提取物。进样前，使用 0.20 μm 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤样品。

采用市售大麻素标准品绘制定量曲线：标准品原液购自西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich），浓度 1 mg/mL，以乙醇稀释至 20 μg/mL 工作液，用于标定样品中大麻素含量。

3. 实验结果

梯度实验

为全面掌握各类大麻素的保留行为，首先在分析型 5 μm 粒径 C18 色谱柱上建立梯度洗脱方法。该梯度程序分为四个阶段：样品进样后，先设置等度保持阶段以优化分离度；第二阶段采用线性梯度洗脱，实现目标组分的分离；随后设置冲洗阶段；最后以初始流动相组成重新平衡色谱柱，为下一针样品分析做准备。

实验除对比三种不同 B 相洗脱剂（乙醇 EtOH、乙腈 ACN、甲醇 MeOH）外，还测试了两种不同柱长色谱柱（150 mm、250 mm）。长色谱柱的梯度程序按比例换算适配短色谱柱，便于结果横向对比。图 1 为乙醇作 B 相洗脱剂所得色谱图，图 2 对应乙腈体系色谱图，图 3 为甲醇体系色谱图。

图1：乙醇为有机相 B 的色谱图；样品：富 CBD 大麻提取物；绿色曲线：ES II 100-5 C18 150×4 mm 色谱柱；蓝色曲线：ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱；虚线：梯度洗脱曲线；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

图2：乙腈为有机相 B 的色谱图；样品：富 CBD 大麻提取物；绿色曲线：ES II 100-5 C18 150×4 mm 色谱柱；蓝色曲线：ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱；虚线：梯度洗脱曲线；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

图3：甲醇为有机相 B 的色谱图；样品：富 CBD 大麻提取物；绿色曲线：ES II 100-5 C18 150×4 mm 色谱柱；蓝色曲线：ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱；虚线：梯度洗脱曲线；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

表1汇总了不同有机相、不同柱长条件下，CBD、Δ9-THC、大麻色原烯（CBC）的保留时间。更换有机相、调整柱长均不会改变三种大麻素出峰顺序：CBD 最先洗脱，其次 Δ9-THC，最后为 CBC。乙醇 - 水流动相体系保留时间最短，甲醇 - 水体系保留时间最长（见表 1）。

表1：三种大麻素的保留时间数据

放大乙醇洗脱色谱图局部（图 4）可见：长色谱柱分析耗时更长，但目标 CBD 峰区域分离度显著提升。基于以上实验结果，后续全部实验选用 ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱。

图4：乙醇有机相梯度 CBD 出峰区间局部色谱图；样品：CBD 大麻提取物；红色框标注 CBD 主峰；绿色曲线：150 mm 短柱；蓝色曲线：250 mm 长柱；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

梯度优化

明确 CBD 出峰时间（表 1）后，锁定目标峰所在时间区间，采用低斜率线性聚焦梯度，优化 CBD 与相邻杂质的分离度。三种有机相体系的梯度色谱图见图 5、图 6、图 7。采用聚焦梯度后，目标峰区域分离效果提升，同时整体分析时长缩短。

图 5 乙醇 - 水流动相体系中，CBD 与其他组分分离效果最优；且相比乙腈、甲醇，乙醇毒性更低、安全风险更小。综合所有实验数据，后续全部实验统一选用乙醇作为有机相 B。

图5：乙醇为有机相 B 的梯度色谱图；样品：CBD 大麻提取物；蓝色曲线：ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱；虚线：梯度洗脱曲线；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

图6：乙腈为有机相 B 的梯度色谱图；样品：CBD 大麻提取物；蓝色曲线：ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱；虚线：梯度洗脱曲线；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

图7：甲醇为有机相 B 的梯度色谱图；样品：CBD 大麻提取物；蓝色曲线：ES II 100-5 C18 250×4 mm 色谱柱；虚线：梯度洗脱曲线；检测波长 228 nm；进样体积 10 μL。

方法优化与上样过载试验

完成梯度筛选后，将方法转移至同柱长、同内径、填料粒径 15 μm 的 C18 色谱柱（与制备级色谱填料粒径一致）。在分析阶段使用制备级粒径填料，可直接通过线性放大将整套方法平移至制备系统。梯度优化流程如图 8 流程图所示，优化目标：在保证分离度不变的前提下，尽可能缩短分析时长、降低流动相消耗量。

经优化后的阶梯梯度方法，分析时长缩短 50%，流动相消耗量同步降低约 50%，且分离度保持稳定；至此，分析级 CBD 纯化色谱方法开发全部完成。

分析方法优化完成后，开展样品体积过载试验，测定不损失分离度的最大进样体积。图 9 为多档进样体积叠加色谱图，重点观察 CBD 峰形变化。所有过载实验组均出现明显峰展宽；进样体积 100 μL 时分离度降至最低，色谱峰不再呈高斯正态峰形。

图8：色谱梯度方法优化流程图（自上而下逐步精简梯度，缩短运行时间）

图9：分析柱过载试验叠加色谱图；样品：CBD 提取物；黑色：10 μL；红色：25 μL；蓝色：50 μL；绿色：100 μL；色谱柱：ES II 100-15 C18 250×4 mm，15μm；流速 1 mL/min；检测波长 228 nm。

最终定型方法将原 10 mm 光程、10 μL 体积的分析型紫外流通池，替换为 3 mm 光程、2 μL 体积的半制备流通池（图 10），更换原因有两点：

原分析流通池最大耐受流速过低，无法匹配后续制备级高流速工况；
样品检测信号接近检测器检出上限，缩短光程、减小流通池容积可降低检测灵敏度，避免信号饱和。

图10：不同流通池分析色谱对比；样品：CBD 提取物；黑色曲线：10 mm 光程分析流通池（10 μL）；金色曲线：3 mm 光程半制备流通池（2 μL）；色谱柱：ES II 100-15 C18 250×4 mm，15μm；流速 1 mL/min；进样 10 μL。

色谱方法线性放大

综合两套系统死体积，对定型分析方法进行线性放大，提升单次上样产物收率。放大方案：色谱柱内径由 4 mm 提升至 20 mm，填料粒径、柱长保持不变。

放大系数（SF）计算公式（公式 1）：

放大系数计算结果为 25，对应参数同步调整：流速由 1 mL/min 提升至 25 mL/min，进样体积由 10 μL 放大至 250 μL；梯度程序通过公式 2 校正。

计算结果显示，梯度各步骤总时长需延长 12 秒。采用放大后方法在制备系统上机测试；因设备无 250 μL 定量环，实验改用 200 μL 定量环进样。图 11 同时展示分析级、放大后制备级色谱图：CBD 峰保留时间出现小幅偏移，源于两套系统泵输送特性差异；进样体积缩小导致信号强度略有下降。整体色谱分离趋势高度一致，证明分析至制备级线性放大方案成功。

图11：方法放大前后色谱对比；样品：CBD 提取物；金色曲线：分析级系统，ES II 100-15 C18 250×4 mm，15μm；流速 1 mL/min，进样 10 μL；绿色曲线：制备级系统，配套半制备紫外流通池，ES II 100-15 C18 250×20 mm，15μm；流速 25 mL/min，进样 200 μL。