制备级纯化方法的放大转移与工艺优化：以大麻二酚（CBD）的制备纯化为例

2026-08-06 17:46:08 北京绿绵科技有限公司

天然产物纯化可采用多种技术，其中包含单柱、多柱制备型液相色谱。但天然提取物基质成分复杂，针对真实样品开发高效、快速、低成本的纯化方法，始终是行业难点。

与蒸馏等传统纯化工艺相比，制备色谱能耗更低、水与有机溶剂消耗量更少，同时产物收率更高。

本应用以富含 CBD 的大麻提取物为原料，开发并优化了间歇式色谱纯化工艺。采用该工艺处理 4 mL 提取物，可得到约 137 mg 大麻二酚（CBD），回收率 95%，纯度达 97%。

1. 引言

单柱间歇式色谱是主流的色谱纯化手段：将定量样品溶于适配溶剂并注入色谱系统，流动相持续输送样品流经色谱柱；不同物质与固定相作用力存在差异，从而实现组分分离。色谱柱出口搭配检测器实时监测洗脱液，通过馏分收集器或切换阀分段收集目标产物；理想状态下，收集的馏分可直接达到所需产物纯度。

2. 系统搭建

本实验采用德国KNAUER AZURA® 系列制备型高效液相色谱（制备 HPLC）完成纯化。整套系统配置：ASM 2.2L辅助控制模块、馏分收集器、最大流速 250 mL/min 制备液相泵、三元低压梯度模块；

ASM 2.2L辅助模块集成单通道紫外检测器、8通进样阀、带10 mL 泵头的样品输送泵。进样阀可搭配不同定量环，由样品泵自动上样，也可手动注射器进样；

检测模块为 190–500 nm 单波长紫外检测器，搭配半制备流通池（见图 1）。

图1：制备型高效液相色谱系统布局（左侧：馏分收集器；中间：动态混合器；右侧从上至下：流动相溶剂瓶托盘、色谱柱架与色谱柱的辅助控制模块、高压输液泵）

随着药用、娱乐用途大麻相关法规逐步放宽，这种存在争议的植物受到广泛研究。目前已在大麻（Cannabis sativa L.）中鉴定出超 500 种植物次生代谢物，包含具备药用价值的大麻素、萜类、黄酮及其他组分。

大麻素属于萜酚类化合物，母核为特征 C21 碳骨架（酸性形态为 C22 骨架），是大麻各类药理活性的核心物质基础。除四氢大麻酚（THC）外，大麻二酚（CBD）是最受关注的大麻素；近年因潜在健康功效得到大量研究，常被用于缓解疼痛、炎症与焦虑。

但从大麻提取物中分离纯化 CBD 及其他大麻素难度极高：提取物基质复杂，共存萜类、蜡质、叶绿素及多种其他大麻素；各类大麻素化学结构、理化性质高度相近，分离难度大，必须配套专属分离工艺。本应用采用间歇式制备色谱，实现富 CBD 大麻提取物中大麻二酚的纯化分离。

3. 样品前处理

乙醇基大麻提取物进样前，使用 0.20 μm 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤。

4. 实验结果

方法优化与上样过载考察

基于前期小试放大实验建立的色谱方法，在制备系统上对提取物开展纯化测试。为简化操作、提升实验重现性，采用预混流动相：分离洗脱液为 70:30 乙醇 / 水混合液，色谱柱清洗液为 90:10 乙醇 / 水混合液；富CBD 提取物重复进样 3 次。图 2为三次色谱图叠加谱图，证明该方法重现性优异。

图2：预混流动相条件下三次制备色谱重叠图谱（样品：富 CBD 大麻提取物；1 号峰：CBD；色谱柱：Eurospher II 100-15 C18 250×20 mm；流速 25 mL/min；进样体积 200 μL。）

制备色谱方法确认后，开展体积过载实验，测定制备柱最大载样容量。图 3 为逐步增大进样体积的重叠色谱图，重点观测目标物 CBD 的洗脱峰形变化：随着进样体积提升，色谱峰明显展宽、前延现象加剧；进样体积达到 5000 μL 时，CBD 与前出峰组分完全无法分离。

图3：制备柱载样过载测试重叠图谱（样品：富 CBD 提取物；黑色：200 μL；绿色：500 μL；蓝色：1000 μL；黄色：2000 μL；红色：4000 μL；紫色：5000 μL；色谱柱：ES II 100-15 C18 250×20 mm；流速 25 mL/min）

馏分分段收集工艺

为提升处理通量，选定 4000 μL 作为单次进样体积；同时缩短洗脱时长，单次运行时间由 25 min 优化至 23 min，节约溶剂与检测时长。设定 CBD 完整出峰区间 3–12 min 为馏分收集窗口，自动馏分收集单份体积 12.5 mL。图 4 为 CBD 出峰段色谱图，全程共收集 18 个馏分；收集馏分与原始提取物采用已建立的乙腈定量方法统一检测分析。

图4：制备色谱 CBD 峰段馏分收集图谱（单馏分体积 12.5 mL（F1–F18）；色谱柱 ES II 100-15 C18 250×20 mm；进样体积 4000 μL）

下表 1 对比原始进样提取物与各馏分检测结果，对可定量 CBD 的馏分分别统计 CBD 含量、纯度、单馏分回收率。

表1：进样体积 4000 μL 条件下各馏分 CBD 含量、纯度、回收率

4000 μL 进样实验数据显示：CBD 总回收率超 95%；7–13 号馏分为 CBD 主要富集段，纯度区间 95%–100%。基于各馏分 CBD 定量数据，划分不同馏分合并区间，理论计算各组合并产物的 CBD 指标，结果见图 5、表 2。

图5：三组不同馏分合并收集区间示意图

表2：不同馏分合并区间下 CBD 理论含量、纯度、回收率

数据结果显示目标产物纯度越高，总回收率越低。例如当合并 7–13 号馏分，CBD 纯度高于 97%，但少量 CBD 随头尾馏分损失；当扩大合并范围至 5–14 号馏分，CBD 收率最大化，但产物纯度下降；最优理论方案：合并 6–13 号馏分，可获得约 96% 高纯度 CBD，总产出约 134 mg。

为验证理论计算结果，重新开展制备实验，限定收集时间窗口 5.50–9.50 min，对应结果见表 3，实测数值与理论预测高度吻合。最终从 4 mL 富 CBD 提取物中纯化得到约 137 mg CBD，产物纯度 97%。

表3：4000 μL 进样体积、选定合并馏分的 CBD 含量、纯度、回收率

5. 结论

原料提取物检测结果表明，样品中主要大麻素成分为 CBD，原料纯度 77%。本应用开发乙醇体系梯度间歇式制备色谱工艺，用于富 CBD 提取物中大麻二酚分离纯化：4 mL 原料（折合 3.4 g 富 CBD 浸膏）可提纯获得 137 mg CBD，总回收率 95%，产物纯度 97%。实验证明：仅搭配输液泵、单波长紫外检测器、馏分收集器的基础款 AZURA 制备液相系统，即可实现样品中高纯度目标天然产物的规模化分离。本工艺仅针对单一大麻素（CBD）优化，可根据目标组分不同，调整方法适配各类原料与其他大麻素分离需求。

附录：材料与实验方法

表1：AZURA 制备液相系统配件清单

仪器模块	规格说明	产品货号
流动相溶剂托盘	AZURA E 2.1L	AZC00
核心辅助控制单元	AZURA ASM 2.2L	AYASM
辅助单元左模块	单通道紫外检测器 UVD 2.1S	ADA03XA
辅助单元中间模块	阀驱动控制器 VU 4.1	AWA04
辅助单元右模块	低压梯度泵 P 4.1S	APG12EB
检测流通池	半制备紫外流通池，光程 3 mm，1/16 英寸管路，体积 2 μL，耐压 300 bar，不锈钢材质	A4044
进样切换阀	8通不锈钢进样阀，1/16 英寸接口	AVN96AE
样品输送泵	10 mL 不锈钢泵头	APG92EB
主制备输液泵	AZURA P2.1L，250 mL 大流量不锈钢泵头	A70060-1
三元低压梯度模块	适配 P2.1L 泵的 AZURA 三元梯度单元	AZZ00AB
分析色谱柱	Eurospher II 100-15 C18 250×20 mm	25JE181E2Q
连接毛细管	1/16 英寸，内径 0.45 mm，不锈钢材质	AZF60
馏分收集器	适配 1/16 英寸、1/8 英寸管路	A59100
动态混合器	制备液相专用，1/8 英寸管路，混合体积 5.9 mL，250 V 供电，耐压 250 bar，钛合金腔体	A70581
控制软件	Purity Chrom® 6 色谱工作站	A2681