项目文章 | 靶向代谢组学助力华东师范大学探究拟南芥细胞死亡机理

目前，对植物中UPR活性调节和细胞死亡转变的分子机制了解甚少。本篇为2019年8月鹿明生物合作客户华东师范大学李小方博士团队在Frontiers in Plant Science发表的题为“Arabidopsis GAAP1 to GAAP3 Play Redundant Role in Cell Death Inhibition by Suppressing the Upregulation of Salicylic Acid Pathway Under Endoplasmic Reticulum Stress”的研究论文，本文作者以拟南芥为研究对象运用靶向代谢组学探究GAAP1到GAAP3在细胞死亡抵抗和微调UPR激活中起着冗余作用。GAAPs的抗细胞死亡功能可能是通过削弱ER应激下SA途径的上调来实现的。

植物作为固着生物，已进化出敏感的检测系统和复杂的信号转导机制，帮助它们应对多种胁迫条件。

其中，对于防御反应的刺激不仅发生在局部，而且也发生在整个植物中，称为系统获得性抗性（SAR）。SAR途径的激活涉及免疫信号水杨酸（SA）的细胞浓度增加。SA诱导致病相关基因（PR）和大量ER驻留基因，以确保PR蛋白的正确折叠和分泌。SA途径在压力下对PCD的抵抗和促进中也起着关键的调节作用。然而，目前尚不清楚内质网应激诱导的细胞死亡是否与SA途径有关。

1.GAAP2在幼年组织和生殖器官中优先表达

GAAP2在各种组织中表达，包括子叶、叶、根和生殖器官。在营养体发育过程中，在子叶顶端、叶原基、根尖和侧根原基中发现强烈的表达信号。随着花的发育，GUS活性在花药和胚珠中很强，但在花瓣中没有。

图1 | GAAP2的表达模式

同时研究了衣霉素（TM）和脱落酸（ABA）对GAAP2基因在苗期转录的影响。研究表明GAAP2的表达在非生物胁迫下没有变化。

图2 | GAAP2转录水平的各种非生物胁迫影响

2.GAAP2的突变增强了植物对内质网胁迫的敏感性

在正常生长条件下，所有突变体和转基因植物都没有表现出明显的地上生长缺陷。当将幼苗转移到含有TM（0.5μg/ml）的培养基中生长几天时，植物存活率随着时间的增加而降低。死亡率在gaap2-1中最高，其次是gaap2-2，这与植物中GAAP2基因的水平一致。

在细胞水平上进一步分析了GAAP2对内质网应激耐受性的作用。当用0.3μg/ml TM处理gaap2突变体和补体系的幼苗48h时，分别通过台盼蓝染色和电导率测定细胞死亡和膜通透性。gaap2-1突变体的细胞显示出最大的损伤，而gaap2-1中的gaap2-2和GAAP2显示出与Col类似的细胞损伤。

数据表明，丢失的GAAP2增加了TM诱导的内质网应激下的细胞死亡，而GAAP2赋予内质网应激耐受性增加。

图3 | GAAP2突变提高了幼苗对TM处理的敏感性

3. 随着GAAP1，GAAP2和GAAP3突变基因数量的增加，植物对ER胁迫的敏感性也增加

①GAAP1，GAAP2和GAAP3在增强植物对ER胁迫的抗性中发挥功能性冗余作用；

②GAAP1，GAAP2和GAAP3中的突变在内质网应激下的细胞死亡抗性中起着冗余的作用；③GAAP1和GAAP3在轻度内质网胁迫恢复期间对植物生长具有传导作用。；

图4 | 植株对TM处理的敏感性增加

4. GAAP1、GAAP2和GAAP3影响轻度内质网应激激活的UPR

GAAP1、GAAP2和GAAP3基因突变的幼苗比野生型和双突变体对内质网胁迫更敏感。在内质网应激下，启动UPR信号通路以缓解应激。GAAP1和GAAP3在急性内质网应激下对UPR的影响较小，但在轻度内质网应激开始时对UPR基因的诱导起拮抗作用。

5. GAAP1-GAAP3参与SA信号抑制细胞死亡的调控

在内质网应激下，IRE1和bZIP28可通过上调NAC089诱导PCD，NAC094和ATPase等下游PCD相关基因的表达促进细胞死亡。研究发现，当0.3或0.5mg/ml TM作用48h时，细胞开始死亡。

为了阐明GAAPs对NAC089途径介导的细胞死亡的影响，分析了经TM作用后24和48h NAC089及其靶基因的表达水平。gaap1gaap2gaap3 中NAC089、NAC094和ATPase基因的上调与野生型对TM处理的应答无显著差异。DCD/NRP是指内质网应激下介导的细胞死亡。内质网应激期间，AtNRP1在AtNRP2和ANAC036下游被激活，从而最终激活空泡处理酶VPEg诱导PCD。在TM处理期间，AtNRP1和ANAC036基因在三突变体和野生型中的表达均上调，但两者之间的上调没有显著差异。数据表明GAAPs抑制PCD可能不是通过NAC089和DCD/NRP途径介导的。

此外，SA途径在压力下对PCD的抗性和促进中也起着关键的调节作用。PR-1和PR-2是SA途径中的关键靶基因。靶向代谢组学检测显示，TM处理后24h，三重突变体gaap1gaap2gaap3中PR-1和PR-2的表达水平明显高于野生型和GAAP3过表达株系中的表达水平。这一发现表明内质网应激下GAAP1突变为GAAP3对PCD的促进作用可能是由SA途径介导的。为了进一步确定SA含量是否会在ER胁迫下受到影响，对5周大的植物进行了测量，这些植物生长于22°C或用0.3μg/ml TM处理48h的SA中。结果表明，内质网应激会上调SA水平。

图5 | GAAP1，GAAP2和GAAP3的突变增强了内质网应激下SA途径下游靶基因的上调

本研究运用靶向代谢组学等多组学分析了GAAP2、GAAP1和GAAP3在内质网应激中的作用。双突变体和三突变体分析表明，GAAP1-GAAP3在抑制细胞死亡和延缓内质网应激诱导的UPR活化中起着冗余作用。UPLC-ESI-MS/MS定量检测表明，内质网胁迫提高了植物体内SA含量。RT-PCR分析表明，在内质网应激下，GAAPs的抗细胞死亡作用可能是通过抑制SA通路的上调来实现的。

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文献参考

Wei Wang, Xin Li, Manli Zhu, et al. Arabidopsis GAAP1 to GAAP3 Play Redundant Role in Cell Death Inhibition by Suppressing the Upregulation of Salicylic Acid Pathway Under Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10 (Article 1032):1-13.

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