通微课堂第三讲：进样量大小对分析结果的影响

在方法开发过程中，我们常常需要确定合适的样品进样量。

如果样品进样量太小，

       可能会导致某些组分丢失，无法被检测；

如果样品进样量很大，

       就会造成色谱柱超载，导致峰宽增加和分离度降低。由于体积过大造成的超载称为体积超载，由于进样量大造成的超载称之为质量超载。

如果保持样品分子浓度不变，

       那么进样不同样品体积对色谱峰形状的影响如图1所示，随着进样体积的增大，峰宽逐渐增加，最后形成平顶峰。如果流动相的流速为最佳状态，则此时允许的样品进样体积V＜0.14（Ld_P）^0.5d_C²

    （其中L为色谱柱长，d_P为填料颗粒大小， d_C为色谱柱内径）。

图1 不同进样体积对分离的影响（从左到右，进样体积增大）

由于色谱柱保留样品分子的容量有限，有时，即使进样较小体积的样品也可能造成峰的加宽和变形，图2为色谱柱超载造成的峰前延、谱带展宽的例子。图中小体积的样品被重复进样，在样品未超载时，形成的色谱峰形对称，随着样品浓度的增加，色谱峰逐渐变宽，并出现直角三角形的超载峰形。此时，样品中单个化合物的重量，往往决定了色谱柱是否超载，只有当单个化合物的进样量太大时，才会发生超载及拖尾而与样品总量无关。

图2 不同样品量对分离的影响（从左到右，样品量减小）

最后需要注意的是，当样品溶剂极性弱于流动相时，可以进样较大的体积而不会对峰宽和分离度造成负面影响；然而，当溶剂极性强于流动相时，往往使得较早洗脱的色谱峰发生形变扭曲，不利于分析。因此，配制样品过程中尽量避免使用极性大于流动相的溶剂。