DIA修饰蛋白组数据攻略—以磷酸化修饰为例（终）

上两集回顾总结：磷酸化组DIA采集数据，在Spectronaut中搜库参数设置，结果查看及导出，结合蛋白组和磷酸化肽组数据结果，基于全蛋白质组结果对磷酸化组结果进行数据标准化处理，从表达量和修饰位点层面多角度解析差异，剔除因表达量变化的全蛋白质组背景，找出特异的修饰变化位点。

任意门：DIA修饰蛋白质组数据攻略—以磷酸化修饰为例（一）

DIA修饰蛋白质组数据攻略—以磷酸化修饰为例（二）

我们能统计不同组间磷酸化位点、肽段或者蛋白的具体情况，通过Venn图能直观感受到此次实验整体的富集效果以及鉴定水平。

再之后就是可以基于标准化后的位点定量值做差异分析，通过火山图、热图将差异位点可视化，后续使用对应蛋白/基因，进行GO功能分析，KEGG通路富集，String互作网络等等进行更进一步挖掘，这个部分和常规蛋白质组数据处理起来相差并不大，上述功能通通都能在悟空云里面实现。

比较特殊的是，我们常会做激酶-底物富集分析(Kinase-Substrate Enrichment Analysis，KSEA)，可以基于已知的底物的磷酸化水平变化来进一步推测激酶的活性变化。使用 KSEAapp（https://github.com/casecpb/KSEA/），根据差异磷酸化肽段及其磷酸化修饰位点，分析其上游可能存在的调控 Kinase，形成 kinase-substrate 网络，并对 Kinase 进行打分。再根据打分值去 kinhub（http://www.kinhub.org/）网站，绘制出相关激酶树图。

同时还可以输出各组差异肽段Motif分析，对不断重复出现的相同蛋白质序列特征进行统计，以期进行更深层次的蛋白激酶功能区域预测。具体操作，也都有视频资料供大家伙参考的哦。

蛋白质组数据分析步骤繁多，虽说有悟空云这么好用的平台能将图表们逐个击破，但是要是有点几下就能一劳永逸实现数据分析该有多好。

Omicscloud，我司自主研发的一站式数据处理平台，为用户提供常见的云平台功能以外，也为实验平台和服务商提供综合解决工具。当中，嵌入了磷酸化蛋白质组分析全流程，上述能通过悟空云实现的分布式操作，在omicscolud中都能一键式输出，并且一定程度上还支持用户自定义选择分析流程，例如是否需要进行全蛋白组标准化，是否需要调整差异倍数等。

（内测中，即将针对购买了Spectronaut软件的尊贵客户开放使用权限）

差点忘记这一茬，Spectronaut里面还对位点置信度打分进行了可视化，我们回到软件Analysis界面，找到任意一条带有磷酸化修饰的肽段，右侧直接会显示该条肽段的MS1和MS2的XIC，选择显示“PTM Localization Plot”。

软件根据碎片离子完整同位素分布，碎片离子、母离子XIC相关性，碎片离子强度，质量精度这几个方面对位点置信度进行打分，并且MS2层面还增加了保留时间维度的信息，以判别出最为可信的修饰位点。

归根结底，要想讲一个好故事，还是得从样本获取、实验前处理、液相质谱、数据检索以及生信挖掘说起。我司有一套非常Easy的方案，可供参考。

EasyPept PTM Phos磷酸化蛋白质组前处理及富集试剂盒（货号：OSFP0005），是我司推出的一款集成了蛋白提取、酶解、除盐以及磷酸肽富集于一体的试剂套装。在保证结果的前提下，使用上也做到十分Easy，并且为了大家伙能在整个实验过程中更为顺畅地进行，还专门3D打印了除盐/富集适配载架，架在EP管和96孔板离心的都有，用过的都说好。

要是遇到大队列，磷酸化试剂盒配上EasyPept AUTO100全自动化蛋白前处理工作站，能帮助我们保证前处理的重复性。

要是想扩大鉴定规模，EasyPept Frac能对微量肽段深度分级，实测磷酸肽最低起始量9ug，单针鉴定量15000+，分12个馏分共鉴定到35000+磷酸化肽段。

Ionopticks Aurora系列色谱柱优异的柱效能在采集时帮助我们获得极致又稳定的分离效果。

DIA采集循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高，母离子无偏倚全碎裂，碎片离子全收集，可以有更为全面的数据进行回溯以及假阳性率排除，对于复杂蛋白样本，特别是低丰度蛋白具有更优异的重现性。

Spectronaut针对phos搜索又有相对完善的处理模板，再加上我们这三篇攻略，抓取有效数据这件事应该变得相对Easy了吧，咳咳。

EasyDIA、悟空云和即将面世的Omicscloud云平台向大家伙敞开怀抱，化身倚天剑屠龙刀，助您披荆斩棘，或许不经意间就能发现科研界武林绝学。

（开始背诵：天之道，损有余而补不足。。。不是

写到这里，我们也算是对DIA采集磷酸化修饰组数据做了一些梳理，内容有点多有点杂，但是，也准备了一张流程图方便各位理解。希望多多少少能为修饰组初学者或者刚接触Spectronaut的伙伴提供一些微小的帮助。

祝您用餐愉快！