易算整理 | 环境宏蛋白组学研究实战：实验到数据处理的全流程解析【上】

在讨论宏蛋白质组学时，很多人可能会首先想到肠道、疾病研究，这是目前较为成熟的应用领域。但是，宏蛋白质组学远不止于此，它已经开始在各种水生和陆地环境中揭示微生物的复杂性，比如河流底泥、海水、污水处理，甚至沙漠地区，还有那些与其他生物体共生的微生物群落。

然而，环境中的宏蛋白质组学研究面临一个重要挑战：缺乏统一的标准流程。许多研究者不得不依赖肠道研究中的工具和方法来处理环境样品，这些方法虽然有效，但在面对环境样品的复杂性时，往往显得不够全面。

为了解决这一问题，易算团队参考了大量最新文献和研究成果，试图为大家提供一个更全面、更实用的工作流程建议。例如，Nebauer等人在他们的研究中详细讨论了宏蛋白质组学在环境应用中的关键步骤和挑战【 Environ Microbiol. 2024;26(5)】，链接见文末。在借鉴这些研究的基础上，我们总结并优化了一套涵盖样本采集、处理和数据分析的全流程。整体篇幅过长，我们切为三部分内容。今天是第一部分，建议从今天开始就收藏阅读。

一般来说，每个宏蛋白质组学的工作流程都需要从采集和保存样本开始，接着是细胞裂解、蛋白提取、酶解成肽段，然后通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）来分离和鉴定这些肽段，最后把这些蛋白进行分类和功能分析。

Overview of the metaproteomics workflow（https://doi.org/10.1111/1462-2920.16637）

• 一、实验设计和样本采集

在设计实验时，要考虑环境因素，比如土壤的结构和深度，这些会直接影响微生物群落的组成和功能。以及，温度和紫外线指数也会调节微生物的活性。因此，环境因素的变化可能会显著影响实验结果。

1.1 样本采集和储存

样本的采集和储存时间应尽量缩短并保持一致，以避免引入系统性偏差。要特别注意避免皮肤和头发中的角蛋白污染样本，因为这些会增加质谱分析中的背景噪声。所需的样本量取决于环境类型。通常，100微克的蛋白足以，包括质量控制和重复实验。例如，为了获得足够蛋白，可能需要收集少至5克的土壤，或者多达100升的水。这些极端例子显示了不同环境中所需的样本量差异。在研究低细胞密度的环境时，可能需要用专用设备进行大规模样本收集。

1.2 样本复杂度

很通常采用过滤和离心的方法将样本分为不同的组分，并去除较大的浮游植物和有机颗粒，从而便于后续的比较分析。如果样本分离不现实，那么在生物信息学分析阶段，可以使用专门的工作流程区分啥是啥谁是谁，但这样处理后的数据集可能会更复杂。如果已知真核生物的种类并且其基因组或蛋白序列可用，那么识别这些蛋白并将其区分开来会相对容易。

1.3 对照样本和环境数据

在传统的单一生物蛋白质组学实验中，对照样本通常是未经处理的，用来作为评估实验效果的基准。在环境研究中，对照样本通常是未受污染的土壤，用来评估污染对微生物群落的影响。一些实验本身具有探索性，比如研究活性污泥中的微生物相互作用时，可能无法设置一个明确的对照样本。在这种情况下，研究通常通过观察特定条件下的蛋白表达水平和微生物群落结构的变化，来推测微生物的功能和相互作用。

环境中的元数据，比如温度、盐度、采样时间、样本的体积和重量、采样位置等记录，都非常重要。这些信息能够帮助我们更好地解释微生物群落的功能变化。

1.4 特定环境的注意事项

水环境：水里的微生物通常很少，所以你需要从大量的水样中浓缩生物质。比如，藻类密集的地方可能每毫升有100万个细胞，而深海样本可能只有1万个。开始采样前，建议先用简单的方法估算一下细胞数量，这样你就知道需要采集多少水了。怎么采样呢？大量水样通常用高容量的采集，这样可以从几千升的水里浓缩到生物样本，不过这方法既昂贵又耗时。对于较小体积的水样，Niskin瓶是个不错的选择，可以采集到特定深度的水样，但要注意，它可能会忽略掉沉到瓶底的微生物。由于水环境变化很快，最好不要把不同时间或地点采集的水样混合，这样容易导致结果不准确。常用的微孔玻璃纤维过滤器（GF过滤器）很适合浓缩水样，它不会引入额外的污染物。

土壤和沉积物：采集后最好仔细检查一下，比如在海洋沉积物中要确保沉积物-水界面完整，在沙漠中要注意表层土壤的结构。不同层次的土壤有不同的微生物，所以可以分别研究这些层次。

怎么保存土壤和沉积物？收集到的样本要过筛，这样可以去掉石头和大块杂物，均质后的样本要存放在-80°C，防止蛋白分解。此外，影响结果有这些因素得考虑。土壤的成分会影响蛋白提取的效率和结果的可靠性。比如，粘土矿物和腐殖质会让蛋白更稳定，也更难分解。所以，在设计提取方法前，最好先了解一下土壤的成分。另外，水流的强度也会影响沉积物中的微生物，所以在研究沉积物时要注意这一点。

共生体和宿主相关微生物：从应用看，在与人类健康相关的研究中，宏蛋白质组学已经成为研究宿主微生物组的重要工具。在非人类环境中，比如昆虫、海绵、珊瑚和植物根，宏蛋白质组学也得到了广泛应用。现在的质谱仪器、生信工具比较灵活，可以同时分析微生物组和宿主的蛋白，为了更好地分析数据，建议提前获取宿主的基因组信息，这样可以更准确地识别蛋白数据。

大气气溶胶：这是一个很多人都没有注意到的样本类型。虽然气溶胶不常被研究，但其实它们也可以通过宏蛋白质组学来分析。通过特定的提取方法，可以识别出其中的细菌、真菌等微生物。但是，研究过程中可能会受到烟灰等杂质的干扰，导致较低的蛋白鉴定率，但这类研究为探索空气中的微生物提供了新的宝藏。

• 二、蛋白提取和多肽准备

在处理环境样品时，由于样品的高度异质性，要采用优化蛋白提取策略，并可能需要预处理步骤以打散微生物群落。不同类型的细胞由于其肽聚糖的组成和厚度、孢子皮质及外层结构、以及膜成分（如多糖、脂肪酸、几丁质微纤维等）的差异，对裂解的抵抗力各不相同。此外，样品基质中如生物膜、粘液、细胞外多糖、无细胞有机物，甚至角蛋白纤维或胶原蛋白等成分，可能进一步保护细胞，从而增加裂解难度。

为了有效裂解这些细胞，通常结合多种裂解技术，包括化学裂解（如使用去污剂或变性剂）、溶剂处理（如酒精或苯酚）、机械裂解（如珠磨、超声、压力处理、研磨或搅拌）、热处理（如快速冷冻或煮沸）以及酶促裂解（如溶菌酶、酶解酶、溶葡萄球菌素）。大多数实验方案通常采用化学或溶剂裂解与机械或热裂解相结合的策略，以增强裂解效果。

在裂解过程中，要选择适当的裂解缓冲液，通常通过加入EDTA和蛋白酶抑制剂来抑制酶促和蛋白水解活性。需要特别注意的是，在样品解冻时，酶活性可能会恢复，因此建议在冷冻状态下加入裂解缓冲液，并在整个操作过程中保持样品在冰上，以防止蛋白降解。此外，为了防止由于反复冻融导致的蛋白质晶体形成和降解，应尽量减少样品的冻融循环。

2.1 蛋白提取

根据样品的特性，蛋白提取方法需要进行定制，因此没有通用的“一刀切”方案。针对不同类型的样品，已经有许多发表的标准化方法，这些方法可以根据具体需求进行优化。为了最大化蛋白的鉴定数量，建议在正式实验前进行预实验。

例如，对于农业和草原土壤，文章到NoviPure土壤蛋白提取试剂盒已被证明可以有效提取蛋白质，分别鉴定出33,765和55,665种蛋白质【Wilhelm et al., 2021; Diamond et al., 2019】。而在处理土壤生物结皮（biocrust）时，同样的试剂盒也被广泛使用，但鉴定的蛋白质数量较少，仅为1,518种【Maier et al., 2022】。

对于更复杂的样品，如脱氮磷去除污泥，SDS与苯酚相分离的方法能够提取出足够的蛋白质，并鉴定出9,537种蛋白质【Lin et al., 2021】。而在处理阿拉伯芥根组织时，使用尿素、CHAPS和Triton X-100的组合可以每毫克组织提取出4.1到9.13微克的蛋白质，并鉴定出4,469种蛋白质【Coleto et al., 2019】。

根际模拟群落和泛滥平原土壤等样品也可以通过优化的SDS与珠磨相结合的方法提取蛋白质，其中根际模拟群落的蛋白质鉴定数量在3,940到8,294之间【Shrestha et al., 2021】。此外，对于复杂环境样品，如好氧颗粒污泥，硼砂、PVPP和苯酚相结合的分离方法能够有效提取蛋白质，并鉴定出超过1,500种差异表达的蛋白质【Geng et al., 2023】。

在沿海和海水样品中，Tri试剂与氯仿相分离或苯酚与SDS-TCA相结合的方法通常用于提取蛋白质，分别鉴定出9,446和2,771到9,345种蛋白质【Zhang et al., 2019; Schultz et al., 2020】。对于石质珊瑚样品，使用TRIzol、苯酚、TCA-丙酮及珠磨相结合的方式，可以每克珊瑚提取出758微克的蛋白质【Cheng et al., 2018】。

最后，对于模拟微生物群落和蚯蚓组织，加热、SDS、珠磨和冻融相结合的方法同样有效，分别鉴定出超过2,000和5,457种蛋白质【Tanca et al., 2014; Tang et al., 2020】。

这些代表性的例子表明，不同类型的样品需要不同的蛋白质提取方法，选择合适的方法是获得高质量数据的关键。

2.2 其他成分去除与蛋白定量

在进行蛋白质提取和LC-MS/MS分析时，环境样品中的各种生物和非生物成分可能会干扰实验结果。尤其是土壤样品，土壤有机质往往会与蛋白质一起被提取出来，形成复合物。这些复合物不仅可能掩盖目标蛋白的条带，还会干扰蛋白质定量和质谱数据的采集。为了减少这类影响，文献里面提到可以采用FASP方法，通过酸化处理将腐殖质和未消化的蛋白质沉淀出来，直接从样品中提取出肽段。

质控确保蛋白质提取效率和获得高质量数据。比如，通过SDS-PAGE凝胶分析蛋白条带评估提取的蛋白质质量。常见的蛋白质定量方法包括分光光度法（NanoDrop）、比色法（如Bradford和BCA方法）、荧光法（Qubit）等。

2.3 肽段制备

在宏蛋白质组学的研究中，肽段制备是一个你不想轻视的步骤。我们通常会采用“bottom-up”的方法，就是先把蛋白质用酶分解成肽段，然后再对这些肽段进行分析。常用的胰蛋白酶（trypsin）就是个好帮手，它专门“剪切”赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg），生成的肽段长度正好适合质谱仪的检测。

不过，单靠一种酶有时不够，特别是面对复杂样品时。为了覆盖更多的蛋白质，提升鉴定的可靠性，有人组合使用多种酶，比如LysC和胰蛋白酶的双剑合璧。这样做不仅增加了可检测的肽段种类，尤其是当样品里包含各种各样的蛋白质时还能在质谱分析中挖掘出更多信息.

2.4 肽段分离

接下来是肽段分离，常规的单纯用数据依赖采集（DDA）方法在面对复杂样品时可能有点力不从心，所以实验通常会考虑通过分离来降低样品的复杂度，从而提升质谱的检测效果。色谱法是主要的肽段分离方法之一，其原理是根据肽段与交换柱材料之间的亲和力差异进行分离。随着技术的进步，越来越多商业化的色谱产品进入市场，这不仅简化了操作，也在某种程度上提高了分离效果和分析效率。

2.5 实验重复性

为了确保重复性，我们需要在每个实验步骤中保持一致性。首先，样品制备过程要保持一致，包括裂解、酶解和分离等步骤，使用相同的试剂、设备和流程，避免任何系统性偏差。其次，使用内标物是个好办法，它们可以帮助跟踪酶解效率、评估质谱仪性能，并协助数据标准化，从而提升数据的可靠性。最后，要尽量在一个批次内完成所有样品的处理和分析，如果必须分批进行，也要尽量减少不同批次之间的差异。通过这些措施，你可以最大限度地提高数据的一致性，确保你的研究结果可靠、可重复。

在下一期，我们将深入探讨以下几个关键步骤：

• 数据采集和分析：随着质谱仪器的不断迭代更新，更高灵敏度和 分辨率的质谱仪器被应用于宏蛋白质组中，覆盖深度也因而不断提升。我们将介绍如何选择合适的质谱数据采集模式，以及如何进行高效的数据解析。
• 数据库的构建：我们将讨论如何构建和优化蛋白质数据库，以提高鉴定的准确性。
• 物种的分类和功能分析：我们将详细介绍如何进行物种分类和功能分析，以更好地理解样品中的蛋白质组组成和功能。
• 关键的一些软件：我们将推荐几款常用的蛋白质组学分析软件，并分享其在实际应用中的经验和技巧。

敬请期待下一期的详细解析，让我们共同探索宏蛋白质组学研究的更多技术和方法。

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