2023-06-02 16:09:49, 质谱创新组学 上海欧易生物医学科技有限公司
武汉大学刘天刚教授课题组联合上海交通大学邓子鑫课题组在Journal of PharMaceutical Analysis期刊发表的题为 “Qualitative analysis of cheMical coMponents in Lianhua Qingwen capsule by HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS coupled with GC-MS”(IF:14.026)的研究成果,通过高效液相色谱-Q Exactive Orbitrap质谱(HPLC-Q Exactive Orbitrap MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)两大仪器分析方法,结合数据匹配分析,对连花清瘟胶囊中化学成分进行了鉴定分析,共鉴定表征包括:酚类、酚酸、苯丙烷类、醌类、萜类、挥发性成分(17种)以及其他类型化学成分共120种,并阐述了一些具有代表性成分(挥发性成分薄荷醇等在内)的裂解途径和特征片段。
这是第一份通过HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC MS鉴定连花清瘟胶囊中主要化学成分的综合报告,本研究的结果可为连花清瘟胶囊的质量控制和标准化提供依据。
中文标题:高效液相色谱-质谱联用技术对连花清瘟胶囊中化学成分的定性分析
研究对象:中药复方—连花清瘟胶囊
发表期刊:Journal of PharMaceutical Analysis
影响因子:14.026
合作单位:武汉大学制药科学学院,上海交通大学生命科学与生物技术学院
运用生物技术:HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC-MS两大质谱联用技术
01
研究背景
连花清瘟胶囊(LHQW)是一种为治疗SARS-CoV-1感染患者而开发的中成药。开发的基础源于两个古方:麻杏石甘汤和银翘散,组方包括:黄芪、甘草、金银花等11种中药材,在国内被广泛用于呼吸道严重感染的治疗。诸多研究表明LHQW具有抗H7N9和H7N1的作用,还有研究表明其对COVID-19也有疗效。LHQW已作为国健委员会发布的新冠肺炎诊疗指南的代表性中药处方。然而,LHQW的使用仅限于中国,为了使LHQW被全球接受,必须充分了解其化学成分和作用机制。因此,确定LHQW的化学成分是必要的,从而进一步实现其质量控制和标准化。
02
研究思路
实验设计思路参考流程图
03
研究材料和方法
1. 材料和方法
1.1化学品和材料:连花清瘟胶囊,乙腈、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等。
1.2样品准备:
LC-MS分析样品:LHQW胶囊原料药棕色粉末0.4 g,20ML的60%甲醇溶解,超声30 Min。12000 r/Min离心,取上清0.22 mm膜过滤。
GC-MS分析样品:1g的LHQW被10ML(正己烷、丙酮、乙酸乙酯)萃取剂超声20Min,12000 r/Min离心,取上清0.22 mm膜过滤。
1.3 HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS 分析:HPLC-HRMS; UltiMate 3000 HPLC仪器系统,采用aQ C18柱(2.1 mm*150 mm, 3 mm)柱温恒定40℃,流速0.2mL/min,进样量5uL。质谱是ESI离子源的Q Exactive-Orbitrap仪器系统,数据采集使用Xcalibur 4.1软件。两种扫描模式:全扫描(分辨率70000),DDA模式(分辨率17500,范围100-1500m/z)用于分析LHQW化学成分。
1.4 GC-MS分析:使用配有AS 3000自动采样器、分裂/无分裂注入器和三重四极杆的TSQ量子XLS质谱探测器的GC气相系统,色谱柱为TR-5 MS毛细管柱(30 mm*0.25 mm,0.25)。进样温度和离子源温度:250℃。电离能为70 eV。收集50-550m/z 扫描范围内的总离子图。数据采集使用Xcalibur 2.2软件。
1.5 数据处理和化合物鉴定:LC-QE-MS 获得的数据采用CD 3.0软件处理,提取ESI正、负模式的分子量、Rt、二级碎片和峰面积的数据矩阵,集成到CD软件中,将二级MS2数据与mzVault库对标。匹配得分大于85分(¼100分)采用。此外,结合文献报道进行比对,提高化合物鉴定的准确性。
04
研究结果
1. 1HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS分析
LHQW胶囊正负离子模式的基峰色谱如图1所示。利用库对齐方法,共鉴定出104种化合物,包括生物碱、黄酮类、酚类、酚酸、苯丙素、醌类、萜类和其他植物化学物(见表1)。结合以往的研究,已鉴定的化合物存在于LHQW配方使用的中药中。未发现绵马贯众植物的化学成分。几种特定化合物的化合物鉴定如下所述。
Fig 1. 使用HPLC-Q Exactive Orbitrap MS分析在(A)电喷雾电离(ESI)正模式和(B)电喷雾离子化负模式下分析连花清瘟(LHQW)胶囊的基峰色谱图。
表:LC-MS检测鉴定中连花清瘟胶囊的化学成分表
tR:保留时间;a该化合物的代表性保留时间。不止一个峰被鉴定为该化合物; b片段离子。Thero m/z:化合物的理论质荷比(m/z)。Exp m/z:化合物的实测m/z。FF:连翘;LJ:忍冬;EH:麻黄;AS:苦杏仁;IR:板蓝根;DC:绵马贯众;HH:鱼腥草;PH:广藿香;RR:大黄;RC:红景天;GR:甘草;MH:薄荷。
2. 黄酮类成分查尔酮B鉴定
化合物71的分子式为C16H14O5,由m/z 285.0760处的[M-H]-峰建立。对于查尔酮B,MS2光谱与先前报道的相似。MS2光谱和可能的破碎途径如图Fig S1A所示。在m/z 270.0530处的峰值表示[M-H-CH3] -的形成。m/z 150.0316处的碱基峰归因于羰基碳周围基团的裂解产生的片段,随后CH3单元的损失。在m/z 177.0189处产生峰值的片段如图Fig S1A所示。mzVault库的对齐结果(Fig S1B;评分89.9),该化合物鉴定为查尔酮B,是甘草中存在的一种化学物质。
Fig S1:(A)ESI负模式下查尔酮 B的MS2光谱和可能的片段(黑色)。碎片(蓝色)的理论质荷比(m/z)。碎片(红色)的实验质荷比(m/z)。分子离子的结构(橙色)。(B)在ESI负模式下,查尔酮 B的实验MS2光谱(Top)和参考MS2光谱之间的比较(Bottom:来自mzVault库)。发现与可能的片段相对应的峰与来自mzVault文库的峰一致(红色)。
3. 萜类化合物獐牙菜苷鉴定
化合物26的分子式为C16H22O9,由m/z 359.1335处的分子离子峰([M+H]+)表示。mzVault库的对齐结果(Fig S2B;评分96.2),该化合物鉴定为獐牙菜苷,是金银花中的一种化学物质。
Fig S2:(A)在ESI正离子模式,sweroside的MS2光谱和可能的片段(黑色)。
4. 醌类化合物大黄素鉴定
化合物97的分子式为C15H10O5,由m/z 269.0454处的[M-H]-峰建立。mzVault库的对齐结果对齐(Fig S3B;评分96.8),结合文献资料比较,确认该化合物为大黄素,是大黄中的化学物质。
Fig S3:(A)ESI负离子模式下大黄素的MS2光谱和可能的片段(黑色)。
5. 酚酸化合物没食子酸乙酯鉴定
化合物31的分子式为C9H10O5,从MS2光谱中m/z197.0451([M-H]-)处的分子离子峰表示(Fig S4A)。与文献数据和库对齐(Fig S4B)比对,化合物31为没食子酸乙酯,是红景天植物中的一种成分。
Fig S4:(A)ESI负离子模式下没食子酸乙酯的MS2光谱和可能的片段(黑色)
6. 苯丙素类化合物连翘苷鉴定
化合物75的质谱中m/z 579.2079处的峰属于[M+HCOO]-加合物,而m/z 533.2019处的峰对应于[M-H]-。在MS2光谱中,特征峰分别为m/z371.1490、356.1250和121.0288。库对齐(Fig S5B)和与文献数据的比较表明,化合物75是连翘苷,连翘中的一种化学物质。可能的片段化途径和特征片段如Fig S5A所示。
Fig S5:(A)连翘苷在ESI负离子模式下的MS2光谱和可能的片段(黑色)。
7. 酚类化合物红景天苷鉴定
化合物17的MS2光谱中m/z 299.1133处的峰归属于[M-H]-离子。一些特征峰和相应的片段位于m/z 137.0605([M-H-Glc]-)和m/z 119.0496([M-H-Glc-H2O]-),数据与先前的研究一致。可能的裂解途径如图S6A所示。库对齐(Fig S6B;得分96.6)将该化合物鉴定为红景天苷,一种红景天中的化合物。
Fig S6:(A)ESI正离子模式下红景天苷的MS2光谱和可能的片段(黑色)
8. 生物碱类化合物腺嘌呤鉴定
化合物7的分子式为C5H5N5。MS2光谱中只有两个特征峰(图S7A):m/z 136.0619([M+H]+)和m/z 119.0356([M+H-NH3]+)。与文献数据和库对齐结果的比较(Fig S7B)表明,化合物7是腺嘌呤,一种板蓝根中的生物碱。
Fig S7:(A)ESI正离子模式下腺嘌呤的MS2光谱和可能的片段(黑色)。
9. 苦杏仁苷鉴定
化合物22具有C20H27NO11的分子式,如m/z 458.1675([M+H]+)和m/z 475.1922([M+NH4]+)处的峰所示。m/z 296.1129处的峰归因于[M+NH4-Glc]+,其他特征片段以及可能的片段化途径如Fig S8A所示。可能的裂解途径与参考文献的比较,以及ESI(-)模式下保留时间的库对齐(图S8B)表明,化合物22是苦杏仁苷,是苦杏仁中的化学成分。
Fig S8:(A)ESI正离子模式下苦杏仁苷的MS2光谱和可能的片段(黑色)。
10. GC-MS分析
三种提取物的总离子色谱图(TICs;Fig S9)相似。在乙酸乙酯中提取的LHQW胶囊的TIC如Fig 2所示。通过将获得的数据与NIST质谱库和先前报道的文献中的数据进行比较,总共鉴定出17种挥发性化合物(表2)。结果表明,用峰面积归一化法计算,主要成分为薄荷醇,相对百分比为97.89%。其他最丰富的成分是广藿香醇(0.47%)等。这里大多数成分是从薄荷和广藿香中提取的萜类化合物。据Kiyohara等人报道,广藿香醇具有抗病毒和抗炎活性。
Fig S9:通过用不同溶剂提取的LHQW胶囊的GC-MS分析获得的总离子色谱图(TICs,4-25分钟)的放大图像。(A) 乙酸乙酯、(B)正己烷、(C)丙酮。MH:薄荷脑;PH:广藿香。
05
研究结论
在本研究中,首次使用HPLC-Q Exactive Orbitrap MS结合GC-MS方法来鉴定LHQW胶囊中该化学物质。LHQW是一种用于治疗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染的症状的中成药。此外,发现MS和MS2光谱库对齐方法是快速识别复杂混合物成分的一种方便方法。本研究共成功检测并鉴定了生物碱、黄酮类、酚类、酚酸、苯丙类、醌类、萜类等120种成分。
本研究结果有助于进一步研究LHQW胶囊的活性化学成分及其作用机制,可为LHQW胶囊的质量控制和标准化提供依据。
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参考文献
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