No.252 | 液相方法开发攻略 - 第三节：关于峰形和理论塔板数

 第252条推送   每周五17:00准时更新

在进行液相色谱分析时，我们通常有以下诉求：

继之前介绍的实现保留与达成分离，今天YoYo老师将为您带来液相方法开发攻略第三节——关于峰形和理论塔板数！

• 实现保留

• 达成分离

• 峰形和理论塔板数

• 寿命

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当色谱峰形出现问题时，首先应确认是由于液相方法导致还是由色谱柱本身引起的。

如果是色谱柱本身引起的前延、拖尾、裂峰等峰形问题，则需要通过冲洗色谱柱、调整流动相等方式进行改善。

YoYo以前推送过关于峰形改善的文章，详细说明了峰形变差的原因及解决对策，请戳下方链接复习~

如果是由于液相方法导致的峰形问题，可以参考以下方法进行优化。

• 改变有机相种类

• 提高柱温

• 减小进样量

• 增加流动相中盐的浓度

• 流动相中添加扫尾剂三乙胺(TEA) 

    添加三乙胺后（根据实验需要调节合适pH），可降低硅胶表面残存硅醇基影响，改善拖尾情况

• 流动相中添加0.1% TFA

    可抑制硅醇基的解离，同时也可作为离子对试剂来增强化合物的保留

在这里，YoYo将对前三点稍作举例说明。

有机相种类对峰形的影响

▲苯扎溴铵

▲不同有机相条件下 苯扎溴铵的分析

*注：峰上标数字为不对称因子。

HPLC Conditions ：

色谱柱：CP C18 AQ S5; 4.6 × 150

流动相：5 mM 醋酸铵溶液*/乙腈 = 35/65

           5 mM 醋酸铵溶液*/甲醇 = 25/75

流　速：1 mL/min

温　度：40 °C

检　测：PDA 214 nm

进样量：20 µL

样　品：0.1 mg/mL

*醋酸铵溶液：每1000 mL中含三乙胺10 mL，用冰醋酸调pH至5.0

以苯扎溴铵的分析为例，将有机相种类由乙腈更换为甲醇，苯扎溴铵峰不对称因子得到了明显改善，由1.81降到1.55。

▲盐酸丁卡因

▲盐酸丁卡因的分析

HPLC Conditions ：

色谱柱：CP C18 MGII S5; 4.6 × 250

流动相：20 mM磷酸盐缓冲液*/乙腈 = 52/48

流　速：1.0 mL / min

柱　温：30°C、40°C

进样量：10 μL

检　测：PDA 310 nm

*磷酸盐缓冲液：含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠各10 mM（pH=6.9）

以盐酸丁卡因的分析为例，适当提升柱温可能会改善峰形，根据具体项目，可以尝试对柱温进行调整，来观察保留时间及峰形等变化，寻找最优条件。

进样量对峰形的影响

方法调整后，峰形还是不理想，这时可能要考虑是不是所使用色谱柱的负载量本身不足，导致样品对色谱柱发生了过载？

当上样浓度过大导致峰形不理想时，可以考虑以下两种思路，更换更适合的色谱柱。

• 选择更高负载量色谱柱

→增加“填料”

→更换比表面积更高的色谱柱

→更换碳含量更高的色谱柱

• 选择吸附更少的色谱柱

→更换金属杂质含量更低的色谱柱（采用高纯度硅胶基材）

→更换表面残留硅醇基更少 / 完全屏蔽的色谱柱

和传统的硅胶填料色谱柱不同，大阪曹逹CAPCELL PAK系列色谱柱采用独特的聚合物包被技术，消除硅胶基材表面的金属杂质和残留硅醇基影响之后，在聚合物包膜上进行官能团的修饰键合，从而能得到更尖锐的峰形、良好的分离能力，以及更高的理论塔板数。

▲传统填料与CAPCELL PAK填料修饰键合示意图

另外，样品和色谱柱之间会存在吸附和解离的过程，当部分样品在色谱柱上吸附过强时，就容易产生峰形拖尾等问题，特别是一些蛋白类样品。

Proteonavi作为一款蛋白/多肽分析专用柱，经过聚合物包被处理技术，填料表面对蛋白样品的吸附更低，因而峰形更好；同时，由于对样品的吸附非常低，即使痕量样品也能被检出，是蛋白质/多肽分析时的好帮手。