No.250 | 液相方法开发攻略 - 第一节：实现保留

2023-05-02 20:23:39, YoYo老师三耀精细化工品销售（北京）有限公司

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今天起YoYo老师要为大家开一个新的干货系列——液相方法开发攻略！

在进行液相色谱分析时，我们通常有以下诉求：

而在液相分析工作中，液相方法的开发一直是一项比较具有难度的工作，不论是新手，还是有经验的老江湖，在面对新项目的方法开发时，总会遇到一些问题。

因此，YoYo特意把大曹三耀技术中心多年来积累总结的经验，梳理汇总为这一系列液相方法开发攻略，并将围绕以下四个方面展开介绍：

• 实现保留

• 达成分离

• 优化峰形

• 考察寿命

今天先来介绍最重要也是最关键的第一节——实现保留，后续几篇将在今后陆续推送，敬请期待哟~

第一步初筛

由于大部分化合物都可以在反相模式下分析，使用反相C18色谱柱即可达成保留及分析，因此，在建立新方法时，反相C18色谱柱也是优先选择的色谱柱。一般可以按照以下步骤进行尝试。

第二步调整pH值

在经过C18色谱柱初筛之后，如果出现了保留不充分的情况，可优先通过调整pH值来实现保留。

在反相模式下，对于不同性质的化合物应采取不同的流动相及相应的色谱柱。一般来说，酸性化合物在酸性条件下保留较强，碱性化合物在碱性条件下保留较强，利用这一性质，调整适合的pH值，并选择相应适合的色谱柱，即可达到良好保留的结果。

在设定流动相pH时需要注意：离子性化合物的保留时间可能会由于流动相pH值设定的不合理而发生漂移，建议将流动相的pH值设定在化合物的pKa±2以上范围。

第三步更换保留模式

如果调整流动相pH也不能解决保留问题，大多数情况下该化合物不适合在反相模式下进行保留和分析，这时，可以考虑更换为下列的保留模式进行下一步的方法摸索。

• 离子交换模式

• 高极性反相模式

• HILIC模式

• 混合模式

强极性、小分子化合物

····

可以使用高极性反相柱或在HILIC模式下进行保留尝试

• 高极性反相柱：ADME-HR / C18 AQ

• HILIC（亲水性相互作用）柱：PC HILIC / NH2 / SILICA

酸性化合物

····

可以使用阴离子交换柱或反相柱+正离子对试剂的方法，使酸性化合物处于分子态，利于增强保留

• 阴离子交换柱：NH2

• 反相柱+正离子对试剂：C18 MG/MGII / SPOLAR C18

碱性化合物、两性化合物

····

可以尝试使用阳离子交换柱或反相柱+负离子对试剂的方法，使碱性化合物处于分子态，增强保留

• 阳离子交换柱：SCX / CR

• 反相柱+负离子对试剂：C18 MG/MGII / SPOLAR C18

分离模式选择例

接下来，以强极性化合物三聚氰胺的分析为例，对保留困难的化合物的方法建立进行说明。三聚氰胺的pKa=8，属于弱碱性化合物。

三聚氰胺

Melamine

M.W. :126.12

更换保留模式——离子交换模式

····

在离子交换模式下进行分析，能对三聚氰胺得到良好保留。具体做法可分为以下两种：

• 反相色谱柱 + 离子对试剂

色谱条件向右滑动

• 离子交换色谱柱分析

色谱条件向右滑动

CAPCELL PAK SCX

CAPCELL PAK SCX是一款聚合物包被型强阳离子交换色谱柱。在5 μm的硅胶填料上形成高分子聚合物包被后，导入磺酸基。聚合物包被型的Si-C结合比一般的化学结合型硅胶系SCX的Si-O-Si结合更稳定，耐久性更强。

• 通过强阳离子交换作用和疏水性相互作用的共同保留机制来进行保留

• 批次间重现性良好

• 耐久性强

更换保留模式——高极性反相模式

····

键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱，兼具高表面极性和一定的疏水性，不仅适用于强极性物质的保留，也适用于强极性物质和疏水性物质的多组分共同分析。

使用键合独特金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱，在简单的2%甲醇条件下即可实现三聚氰胺和双氰胺的良好保留与分离。这得益于ADME独特的表面极性与保留模式。

色谱条件向右滑动

CAPCELL PAK ADME-HR分析三聚氰胺与双氰胺结果

*峰1：双氰胺，峰2：三聚氰胺

CAPCELL PAK ADME-HR

CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱采用独特的立体笼状金刚烷基官能团——ADME(adamantane)金刚烷，我们首次将这种笼状结构的金刚烷基团以精确控制的键合密度导入填料表面，通过“新型官能团”和特有的包被型填料表面“控制技术”，我们将保持疏水性又提高表面极性变为可能；由于金刚烷特有的笼状结构所带来的立体选择性，还赋予了ADME-HR分离结构类似化合物的能力。

更换保留模式——HILIC模式

····

亲水性相互作用色谱法（HILIC）是针对在常规C18色谱柱上保留较弱的强亲水性化合物的保留方法。在HILIC模式下，通过键合极性官能团的固定相与反相模式常用的CH3CN / H2O系流动相条件相组合，对亲水性化合物进行保留与分离。

因此，HILIC是在HPLC的分离模式中最常使用的反相相反的模式，故也被称为“反反相模式”。

大阪曹達使用构成细胞膜的卵磷脂亲水性部位——PC基团（磷酸胆碱基团），作为PC HILIC色谱柱的官能团，对亲水性化合物的保留更具优势。

如下图，使用PC HILIC色谱柱和另一款其他品牌色谱柱Column B进行对比，对三聚氰胺进行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH=3.0）条件下，PC HILIC色谱柱所得保留时间更长，理论塔板数更高，即使是在水相比例为20%时，也得到了足够的保留。