揭秘科研“瑕疵”:如何解决质谱成像中的批次效应?

2023-05-08 16:35:17, 质谱创新组学 上海欧易生物医学科技有限公司






质谱成像是一种用于分析生物分子分布的成像技术,它通过在组织切片上扫描激光并收集质谱数据来获取组织中生物分子的空间分布信息。虽然许多初始技术挑战现已得到解决,但所谓的批次效应已经显著地阻碍了从特定中型研究中获得可靠数据比较。


本次的干货将主要解决以下问题:

在质谱成像数据中批次效应可能在哪些层次(像素、切片、玻片、时间和位置)?可能对生物标志物发现或多元分类的影响?后续会有更多干货内容,记得关注收藏哦~



如何解决质谱成像中的批次效应?


在质谱成像技术进行实验时,常常会出现批次效应,这会导致实验结果的误差和不可重复性,从而影响研究结论的可靠性和准确性。图1展示了质谱成像中批次效应的类型和影响


图中a显示了技术变异可以掩盖给定生物效应大小的情况,这可以单独出现(绿色矩形)或在累积批次效应(红色三角形)的情况下发生。


图b展示了批次效应的不同类型和影响,包括信号强度偏移、信号峰的位置偏移、峰形状和宽度的变化等。


图 1:质谱成像中的批次效应


批次效应可以在像素(pixel)、切片(section)、载玻片(slide)、时间(time)和位置(location)等不同层次上表现出来。



质谱成像在不同层次上的批次效应



1、质谱成像在像素层次上的批次效应


在质谱成像中,数据集是从组织切片的不同位置获取的质谱集合。图 2 展示了在像素、区域、切片和玻璃片级别上的批次效应。


图2:质谱成像在像素、切片和玻璃片级别上的批次效应


在 (a) 中,基质 (左) 或每个像素固有的化学成分 (右) 导致的离子抑制可以导致组织中信号强度的人工差异,从而导致像素和区域相关的批次效应。 


(b) 组织区域的不同化学组成也会影响组织上消化速度,从而导致区域相关的批次效应。


 (c) 区域相关的批次效应也可能是由于MS运行期间系统性的技术变异而引起的。


 (d) 在由71个连续组织切片组成的数据集中观察到了在切片、玻璃片和日期级别上的批次效应。


2.数据准备质谱成像在切片层次上的批次效应


和一个像素在一个区域中的位置类似,不同位置的切片也可能因测量本身的批次效应而暴露不同(图2d)。


图3展示了组织切片级别的批次效应可能对多变量像素分类的影响。图(a)显示了32个癌症组织的像素级分类,其中红色和黑色代表两种不同的临床特征。图(b)中不同的颜色表示每个交叉验证阶段留出用于测试的数据。


结果显示,在十倍交叉验证中,分类器的准确率显著更高(图c)。然而,这种情况在临床实践中是不现实的,因为新的质谱成像数据对分类器来说是未知的。


图3:组织切片层次的批次效应对多变量像素分类的影响


3.质谱成像在载玻片层次上的批次效应


玻璃载玻片可以被视为一个批次,因为该载玻片上的所有像素,无论它们属于一个或多个组织切片,都经历了相同的样品制备和质谱分析过程(图2d)。当分析组织微阵列(TMA)时,这种情况可能会变得明显。


图4这张图展示了在组织微阵列(TMA)中可能存在的批次效应。由于不同类别之间在TMA之间可能分布不均,因此在生物标记物的发现中可能会出现假阳性结果。


图4:TMA中可能出现的批次效应



批次效应的消除方法



在质谱成像实验中避免、识别和纠正批次效应的方法中,研究设计是最有效的手段之一,可以通过随机化、技术重复和阻断来减少技术偏差。


在像素级别,异常值检测、数据转换和鲁棒数据统计是处理批次效应的有效方法。在质谱成像数据中,可以使用单变量汇总统计量(如均值、标准差、中位数、四分位数)来识别潜在的异常值。然而,考虑到质谱成像数据的多变量特性,使用主成分分析(PCA)来识别异常值可能更为可取,例如通过在二维或三维的PCA空间中使用误差椭圆(如图5b,左)。对于3D数据,回归分析可以用来识别离群的切片,这些切片通常与3D堆叠中的趋势偏离(如图5b,右)。


图5展示了通过实验设计和异常值检测来缓解批次效应的方法。首先,通过阻挡法(Blocking)来消除质谱成像研究中已知的干扰因素(如玻片)。为了检测玻片的异常值(b左),可以利用从质量控制中获得的分子谱的主成分分析(红色点在绿色95%误差椭圆之外)。在三维(3D)质谱成像中,可以使用回归分析来检测不符合预期信号强度梯度的异常切片(b右)。

图5:实验设计和异常值检测来缓解批次效应



批次效应的挑战



为了得到足够数量的生物学重复样本用于临床研究,可以将不同中心的研究结果结合起来,以提高发现真正生物学差异的机会。然而,由于实验设置的多参数性质,标准化方法的开发仍然具有挑战性。以下几个解决方案:

(1) 实验工作流的优化和标准化;

(2) 质量控制的建立;

(3) 在不同层面上进行归一化以减少批次效应的影响。


图6展示了通过样品间归一化来调整批次效应的方法。为确保多个样品集之间的可比性,可以使用各种方法来估计缩放因子。


图6:通过样品间归一化来调整批次效应


总结


现在,质谱成像必须致力于研究,以指导下一代仪器、软件和实验工作流程的开发和验证,以更好地理解、避免缓解质谱成像中发生在不同层面的批次效应。专门致力于质量保证和标准化的

质谱成像科学社区联盟,如MALDISTAR METASPACE 


以上就是这期的干活内容了,您有任何问题,都可以下方微信,联系我们哦~




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