揭秘科研“瑕疵”：如何解决质谱成像中的批次效应？

在质谱成像技术进行实验时，常常会出现批次效应，这会导致实验结果的误差和不可重复性，从而影响研究结论的可靠性和准确性。图1展示了质谱成像中批次效应的类型和影响。

图中a显示了技术变异可以掩盖给定生物效应大小的情况，这可以单独出现（绿色矩形）或在累积批次效应（红色三角形）的情况下发生。

图b展示了批次效应的不同类型和影响，包括信号强度偏移、信号峰的位置偏移、峰形状和宽度的变化等。

图 1：质谱成像中的批次效应

批次效应可以在像素（pixel）、切片（section）、载玻片（slide）、时间（time）和位置（location）等不同层次上表现出来。

在质谱成像中，数据集是从组织切片的不同位置获取的质谱集合。图 2 展示了在像素、区域、切片和玻璃片级别上的批次效应。

图2：质谱成像在像素、切片和玻璃片级别上的批次效应

在 (a) 中，基质 (左) 或每个像素固有的化学成分 (右) 导致的离子抑制可以导致组织中信号强度的人工差异，从而导致像素和区域相关的批次效应。 

(b) 组织区域的不同化学组成也会影响组织上消化速度，从而导致区域相关的批次效应。

 (c) 区域相关的批次效应也可能是由于MS运行期间系统性的技术变异而引起的。

 (d) 在由71个连续组织切片组成的数据集中观察到了在切片、玻璃片和日期级别上的批次效应。

和一个像素在一个区域中的位置类似，不同位置的切片也可能因测量本身的批次效应而暴露不同（图2d）。

图3展示了组织切片级别的批次效应可能对多变量像素分类的影响。图(a)显示了32个癌症组织的像素级分类，其中红色和黑色代表两种不同的临床特征。图(b)中不同的颜色表示每个交叉验证阶段留出用于测试的数据。

结果显示，在十倍交叉验证中，分类器的准确率显著更高（图c）。然而，这种情况在临床实践中是不现实的，因为新的质谱成像数据对分类器来说是未知的。

图3：组织切片层次的批次效应对多变量像素分类的影响

玻璃载玻片可以被视为一个批次，因为该载玻片上的所有像素，无论它们属于一个或多个组织切片，都经历了相同的样品制备和质谱分析过程（图2d）。当分析组织微阵列（TMA）时，这种情况可能会变得明显。

图4这张图展示了在组织微阵列(TMA)中可能存在的批次效应。由于不同类别之间在TMA之间可能分布不均，因此在生物标记物的发现中可能会出现假阳性结果。

图4：TMA中可能出现的批次效应

在质谱成像实验中避免、识别和纠正批次效应的方法中，研究设计是最有效的手段之一，可以通过随机化、技术重复和阻断来减少技术偏差。

在像素级别，异常值检测、数据转换和鲁棒数据统计是处理批次效应的有效方法。在质谱成像数据中，可以使用单变量汇总统计量（如均值、标准差、中位数、四分位数）来识别潜在的异常值。然而，考虑到质谱成像数据的多变量特性，使用主成分分析（PCA）来识别异常值可能更为可取，例如通过在二维或三维的PCA空间中使用误差椭圆（如图5b，左）。对于3D数据，回归分析可以用来识别离群的切片，这些切片通常与3D堆叠中的趋势偏离（如图5b，右）。

图5展示了通过实验设计和异常值检测来缓解批次效应的方法。首先，通过阻挡法（Blocking）来消除质谱成像研究中已知的干扰因素（如玻片）。为了检测玻片的异常值（b左），可以利用从质量控制中获得的分子谱的主成分分析（红色点在绿色95％误差椭圆之外）。在三维（3D）质谱成像中，可以使用回归分析来检测不符合预期信号强度梯度的异常切片（b右）。

图5：实验设计和异常值检测来缓解批次效应

为了得到足够数量的生物学重复样本用于临床研究，可以将不同中心的研究结果结合起来，以提高发现真正生物学差异的机会。然而，由于实验设置的多参数性质，标准化方法的开发仍然具有挑战性。以下几个解决方案：

(1) 实验工作流的优化和标准化；

(2) 质量控制的建立；

(3) 在不同层面上进行归一化以减少批次效应的影响。

图6展示了通过样品间归一化来调整批次效应的方法。为确保多个样品集之间的可比性，可以使用各种方法来估计缩放因子。

图6：通过样品间归一化来调整批次效应

现在，质谱成像必须致力于研究，以指导下一代仪器、软件和实验工作流程的开发和验证，以更好地理解、避免缓解质谱成像中发生在不同层面的批次效应。专门致力于质量保证和标准化的

质谱成像科学社区联盟，如MALDISTAR 或METASPACE 。

以上就是这期的干活内容了，您有任何问题，都可以扫描下方微信，联系我们哦~

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