Nature | 菌群代谢物3-IAA有望大大提升胰腺癌化疗疗效！

招募30名mPDAC患者，其中23名未接受抗生素治疗，在化疗开始前收集其粪便样本对肠道菌群进行分析（图1a）。根据放射学反应；或根据无进展生存期（PFS）和血清肿瘤标志物的减少，将患者队列分为治疗有效的R组（n = 11）和治疗无效的NR组（n = 12）。结果显示，R组与NR组的肠道菌群呈现显著差异（图1b）。

为了研究菌群与化疗反应之间的潜在因果关系，将前10名招募的R和NR组的菌群转移到无菌小鼠体内，然后注射胰腺癌KPC细胞。其中，在两组（R和NR）中，有四名患者接受了亚叶酸（FOLFIRINOX）治疗，一名患者接受了吉西他滨和纳布-紫杉醇（GnP）治疗。结果显示，无论最初的供体治疗方法是哪一种，在化疗治疗后，与定植于NR组菌群的小鼠肿瘤相比，定植于R组菌群的小鼠肿瘤减小（图1c）。

鉴于肠道菌群有可能转入PDAC肿瘤，进行16S rRNA测序分析瘤内菌群。结果显示，12个肿瘤中只有2个检测到瘤内细菌，因此推测对化疗的反应是通过循环菌群衍生的代谢物而非细菌本身进行调控的。收集R和NR组的患者血清以及相匹配的定植小鼠的血清，进行靶向代谢组学检测。结果显示，与NR组相比，色氨酸代谢物3-IAA是R组中显著增加最多的代谢物（图1d）。与此一致的是，与NR组相比，3-IAA在定植于R的无菌小鼠血清中含量也显著增加（图1e）。为了确定R组的哪些肠道细菌可能有助于增加3-IAA的产生，分析R组的菌群中常见的产生3-IAA的细菌菌株的丰度。在分析的15个3-IAA生产者中，发现R组的脆弱拟杆菌和多形拟杆菌增加，并证实了它们在体外产生 3-IAA 的能力。

那么是否可以通过调节3-IAA的前体色氨酸的饮食浓度来改变小鼠血清中的3-IAA水平，从而影响化疗的疗效呢？由于色氨酸会损害抗肿瘤免疫反应的发展，从而促进肿瘤的生长，首先确定不同时间长度的饮食干预的影响。结果显示，四天的高色氨酸饮食干预可以避免促肿瘤生长的效果；且四天已经足以增加被R菌群定植的无菌小鼠血清中3-IAA的浓度（图1f）。此外，当这种饮食干预与FIRINOX相结合时，观察到肿瘤重量降低（图1g）。此外，3-IAA血清水平与肿瘤重量呈现负相关（图1g）；而在移植了NR患者菌群的小鼠身上，未出现上述现象。这提示，高色氨酸饮食的效果可能是由3-IAA介导的。

随后，在无特定病原体（SPF）的小鼠中直接补充3-IAA后，发现其足以达到在用R菌群定植的小鼠中测得的浓度，且在SPF和在NR定植的无菌小鼠中均可提升化疗疗效（图1h）。然而，在 R 组患者或 R 组小鼠中增加的另外两种代谢物，即吲哚-3-丙酸（IPA）和马尿酸，与 FIRINOX 联合处理后均未发现与 3-IAA 相似的功效。总之，菌群衍生的色氨酸代谢物 3-IAA 在对化疗有反应的人和小鼠的血清中增加，且 3-IAA 的水平可以通过色氨酸的饮食干预来调节；3-IAA 甚至有效提升了化疗耐药的 PDAC 患者的化疗疗效。

菌群代谢物，特别是色氨酸代谢物，在塑造先天性和适应性免疫方面具有关键作用，这反过来又在决定PDAC的化疗效果和预后方面发挥重要作用。分别比较分析未接受化疗以及接受R-或NR-菌群移植无菌小鼠中的肿瘤浸润免疫细胞。结果显示，与NR菌群移植小鼠相比，R菌群移植小鼠的CD8+T细胞的频率增加，中性粒细胞减少。与未经治疗的小鼠相比，则未观察到肿瘤浸润性免疫细胞的任何变化。当被肠道菌群激活时，CD8+T细胞可以诱导PDAC的好转。然而，通过抗体处理耗尽CD8+或同时耗尽CD4+和CD8+T细胞，并未降低接受标准或高色氨酸饮食的R-菌群移植小鼠的化疗疗效。同样，CD4+和CD8+T细胞的耗竭并没有降低3-IAA和FIRINOX对SPF小鼠的疗效。因此，3-IAA的效果似乎并不取决于T细胞的存在。

中性粒细胞在PDAC中非常丰富，中性粒细胞减少与mPDAC的良好预后有关。3-IAA对具有高浓度骨髓过氧化物酶（MPO）的细胞具有特异性毒性，而MPO是中性粒细胞的标志之一。从机制上讲，MPO可以氧化3-IAA，诱发有毒产物，如3-亚甲基-2-羟吲哚（MOI）。与此一致，结果显示，用3-IAA和FIRINOX培养骨髓来源的中性粒细胞，而非T细胞，会导致细胞存活率下降。此外，在骨髓来源的中性粒细胞培养物中加入MPO或使用内源性MPO水平较高的未成熟中性粒细胞（前中性粒细胞）会增加3-IAA和FIRINOX的毒性。相比之下，IPA并没有增加FIRINOX在体外诱导中性粒细胞死亡的功效。进一步表征中性粒细胞对3-IAA和FIRINOX反应表明，该处理诱导了中性粒细胞脱颗粒和坏死，但没有导致中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成或凋亡。随后在小鼠体内验证该结果，发现3-IAA和FIRINOX的组合降低了SPF小鼠肿瘤和脾脏中中性粒细胞的频率和数量，而单独使用3-IAA治疗却并非如此（图2a）。

鉴于中性粒细胞衍生的MPO在3-IAA释放有毒产物中的关键作用，随后探究这是否可以解释3-IAA和FIRINOX治疗肿瘤疗效增加。从野生型或Mpo^-/-小鼠中建立骨髓嵌合体。结果显示，用FIRINOX和3-IAA治疗会导致中性粒细胞的耗竭，并在野生型重组小鼠中显示出协同效应；而在用Mpo^-/-骨髓重组的小鼠中，加入3-IAA并没有导致肿瘤减小（图2b），这表明MPO对3-IAA和FIRINOX的疗效至关重要。还发现，与单独使用FIRINOX相比，使用3-IAA和FIRINOX治疗后，野生型SPF小鼠的肿瘤中3-IAA氧化产物MOI增加，进一步支持MPO的作用。且在Mpo^-/-骨髓重组小鼠的肿瘤中，MOI的水平强烈降低。

已报道芳烃受体（AhR）作为3-IAA和其他吲哚的细胞内受体具有重要作用，探究了Ahr^-/-骨髓重组小鼠是否对3-IAA和FIRINOX有抵抗力。结果表明，用3-IAA和FIRINOX治疗后，Ahr^-/-骨髓重组小鼠的肿瘤大小与野生型重组小鼠的肿瘤大小相同（图2c）。这表明，3-IAA和FIRINOX的疗效是由免疫细胞产生的MPO介导的，而非AhR信号介导。

3-IAA通过MPO的氧化在培养的中性粒细胞中诱导活性氧（ROS）的产生并且 ROS 是化疗诱导的细胞死亡的主要介质。因此，假设3-IAA和FIRINOX在有MPO的情况下的疗效是由ROS介导的。分别用3-IAA、3-IAA和中性粒细胞、3-IAA和MPO与或不与化疗一起培养小鼠和人类PDAC细胞。结果表明，3-IAA以剂量依赖的方式直接增加ROS。中性粒细胞或MPO的加入进一步增强ROS在癌细胞中的积累，并且MPO的加入降低了小鼠和人类PDAC细胞系的活力。且直接加入3-IAA氧化产物MOI也增加了FIRINOX对小鼠和人类PDAC细胞的功效。

为了测试在小鼠体内，3-IAA和FIRINOX处理对ROS诱导的影响，用3-IAA和FIRINOX或FIRINOX单独处理SPF小鼠。通过流式细胞仪测量癌细胞中的ROS或在整个肿瘤组织学染色中测量硝基酪氨酸，结果显示，与体外数据一致，用3-IAA和FIRINOX处理诱发高氧化应激。流式细胞仪结果显示，与野生型骨髓重组小鼠相比，用3-IAA和FIRINOX处理后，Mpo^-/-的癌细胞中的ROS水平要低很多，进一步强调ROS产生和3-IAA氧化之间的联系。随后探究哪些氧化应激相关的途径参与了3-IAA和FIRINOX处理的肿瘤中ROS的积累。比较3-IAA和FIRINOX治疗的小鼠的肿瘤和单独用FIRINOX治疗的小鼠的肿瘤，分析mRNA测序数据中产生ROS或降解ROS的酶的表达。结果显示，ROS降解酶谷胱甘肽过氧化物酶3（GPX3）和谷胱甘肽过氧化物酶7（GPX7）在体内被下调，用3-IAA、FIRINOX和MPO处理导致体外KPC细胞中GPX3和GPX7的类似下调。敲除癌细胞中的Gpx3和Gpx7足以增加FIRINOX处理后的ROS积累，并增加癌细胞对FIRINOX的敏感性，其程度与3-IAA和FIRINOX相似。且敲除Gpx3足以在体内建立对FIRINOX的敏感性。

接着，用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理R-菌群（即高3-IAA）小鼠后，FIRINOX的疗效消失，证明了ROS的积累对3-IAA和FIRINOX的疗效至关重要（图3a）。随后验证高水平 ROS 的分子反应，从3-IAA 和 FIRINOX 或单独用 FIRINOX 治疗的 SPF 小鼠中分离肿瘤并进行靶向蛋白质筛选和 mRNA 测序（图3b）。结果表明，自噬是用3-IAA和FIRINOX治疗的小鼠分离出的肿瘤中被下调的主要途径之一，也是PDAC增殖和发展的重要代谢程序。此外，在用3-IAA和FIRINOX治疗的SPF小鼠分离的肿瘤中，自噬底物LC3B减少，p62/SQSTM增加（图3c）。与此一致，与来自NR移植小鼠（低3-IAA）的肿瘤相比，来自R-菌群移植的小鼠（高3-IAA）的肿瘤也显示出LC3B的丰度降低，p62/SQSTM1的丰度增加。在用3-IAA和FIRINOX治疗的小鼠中，LC3B和p62/SQSTM的变化伴随着肿瘤细胞增殖的下降，但未观察到凋亡细胞数量的变化（图3c）。

为了探究自噬的下调是否是解释3-IAA和FIRINOX协同作用的一个重要下游机制，或者它是否仅仅与观察到的癌细胞增殖的减少有关。首先，观察到用海藻糖处理导致自噬报告细胞中GFP/RFP比例的下降，可以使自噬活性正常化（图3d）。其次，海藻糖足以完全逆转3-IAA和FIRINOX的治疗效果，与ROS清除剂NAC类似（图3e,f）。第三，用自噬阻断剂羟氯喹处理可以使来自NR-菌群移植小鼠（低3-IAA）的肿瘤对FIRINOX治疗敏感（图3g）。最后，通过多西环素诱导的显性失活ATG4B蛋白（mSt-ATG4B）抑制癌细胞的自噬，与对照细胞（mSt）或没有多西环素处理的mSt-ATG4B细胞相比，SPF小鼠对FIRINOX治疗的敏感性增加。总之，当FIRINOX治疗期间存在3-IAA和MPO时，ROS的积累增加，癌细胞的应激适应能力受损（即自噬作用被削弱），最终诱发肿瘤细胞的增殖减少。

为了研究3-IAA的潜在治疗意义，测试了用3-IAA和FIRINOX对小鼠生存的影响、3-IAA和FIRINOX单独使用都不能延长小鼠的生存时间，但是二者联合可以显著延长小鼠的生存时间（图4a）。还发现，3-IAA与FIRINOX在治疗结直肠癌（MC38）或肺癌（LLC）方面、3-IAA与GnP在治疗PDAC小鼠模型中也有协同作用，这些结果强调了3-IAA在癌症治疗中的潜在作用。

随后在临床上进行验证。结果显示，对化疗有反应的患者的中性粒细胞减少率较高，这与的小鼠数据和已知的中性粒细胞减少与PDAC预后之间的关系一致。且化疗后中性粒细胞减少的水平，而非淋巴细胞或单核细胞减少的水平，与3-IAA血清浓度相关，这是由于它们的MPO水平不同而预期的（图4b-d）。此外，在汉堡PDAC临床队列中，观察到血清3-IAA浓度与无进展生存期（PFS）或总生存期存在显著相关性（图4f、g），并在路德维希-马克西米利安大学医院（LMU）的第二个mPDAC患者队列（慕尼黑队列）验证了这些发现（图4h,i）。这同时揭示了已有的临床可评估的标记物在预测化疗反应方面的缺失，且患者固有特异性（年龄、性别和体重）和肿瘤特异性（肿瘤大小和肿瘤标记物）变量均与PFS无显著相关性（图4e）。

本研究利用16S rRNA测序和代谢组检测，发现菌群衍生的色氨酸代谢物吲哚-3-乙酸（3-IAA）在对治疗有效患者中增加。粪便菌群移植、短期膳食补充色氨酸和口服3-IAA可以增加PDAC小鼠模型的化疗疗效。机制上，肠道中的脆弱拟杆菌和多形拟杆菌等，将人体摄入的色氨酸代谢成3-IAA；随后3-IAA从肠道进入血液，被中性粒细胞所吸收，在骨髓过氧化物酶的作用下，3-IAA转化成一种毒性分子，导致癌细胞内活性氧水平上升，抑制癌细胞的自噬作用，并最终影响了癌细胞增殖。最后，在两个独立的PDAC队列中验证了3-IAA的水平和化疗疗效显著相关。总之，本研究确定了一种菌群衍生的代谢物在PDAC的治疗中具有临床意义，为饮食联合化疗治疗难治癌症的临床研究奠定了基础。

Microbiota-derived 3-IAA influences chemotherapy efficacy in pancreatic cancer. Nature. 2023.

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