默克病毒安全专家小讲堂 | 病毒清除验证优化策略之"在线添加病毒（In Line Spiking)"

使用吸附性预过滤器和除病毒滤器串联已被证明能够提高除病毒滤器的载量和稳健性^[1]。通过预过滤器去除料液中的堵膜成分，从而减少杂质对除病毒滤器载量的影响。

虽然串联预过滤器能够提高除病毒滤器的载量，但预过滤器可能截留和吸附病毒，干扰除病毒滤器去除能力的检测结果^[2]。因此在病毒清除验证中，需要将预过滤器和除病毒过滤器分离。通常的做法是先将料液进行批量预过滤，然后加入病毒，再进行批量除病毒过滤。

先批量预过滤再批量除病毒过滤的缩小模型，并不能直接代表预过滤和除病毒过滤在线串联的生产过程。相对于串联过滤中样品搁置时间仅几秒钟，批量预过滤的料液可能需要放置几个小时。在放置的这段时间内样品可能会重新产生堵膜杂质，从而降低除病毒滤器载量。

图中显示的在线加病毒系统中，当过滤开始时，病毒原液将会持续地加入，和预过滤后的料液按比例在线静态混合后，被持续地取样，最终被除病毒滤器过滤。

其中静态混合器能够凭借流体本身的运动，借助静态混合单元产生层流和湍流，使流体得到分散混合，制备均一浓度的样品。层流和湍流会对蛋白质造成剪切力的影响，因此选择合适的静态混合器降低剪切力，保留时间及残留体积至关重要^[4]。

病毒原液的加入和混合后样品的抽取，是通过双向注射泵来实现的。注射泵能够准确地控制病毒加入比例，并且维持加病毒和取样的速度一致。在过滤的过程中，持续检测过滤流速。根据流速的衰减，注射泵加入病毒的速度也随之调节降低，以维持病毒加入的百分比始终保持一致。根据法规要求，病毒加入体积比例不得超过10%，以减小对料液本身性质的影响^[5]。因此对注射泵的精度范围有较高的要求。

如何验证在线系统的准确性？利用电导测定溶液中的盐浓度变化简单而准确，50%的浓度差异对应0.3 log10变化，而病毒清除验证中病毒检测的灵敏度为±0.5 log10。因此我们采用加入盐的方式代替加入病毒，来测试在线系统混合前后的表现。以下是测试结果：

Table 1. Salt Spiking Concentrations

实际取样和理论值的浓度差异为<9%，达到了质量平衡，并且证明系统残留体积很小可以忽略不计。

我们使用单抗样品，设计串联和In line Splikng的对比试验。

然而加入5% xMuLV病毒后，和未加入病毒相比流速出现明显衰减。这表明加入病毒后出现了杂质造成堵膜，因此批量过滤中样品经过预过滤后放置和病毒引入都是造成严重堵膜的原因^[6]。即使如此，使用串联过滤代替批量过滤，滤器载量从200L/m^²提升至420L/m^²，载量提高2.1倍。

Table 2. Inline and Standard Spiking LRV Results

病毒清除验证中病毒检测的灵敏度为±0.5 log10，串联过滤和批量过滤的LRV结果经对比差异很小，一致性非常好。串联过滤中病毒原液稀释后的理论滴度和实际取样检测滴度，以及批量过滤中取样检测滴度，三者的差异也很小。证实了在线系统能够充分混合病毒和样品，并且在混合的过程中剪切力没有造成MMV和xMuLV病毒的活性损失。