默克病毒安全专家小讲堂 | 《生物制品病毒安全性控制》解读（下篇）

2023-02-13 10:27:29, 高飞 Merck工艺解决方案

针对生物制品的病毒安全控制，2020药典给出了权威的指导原则，详见新增章节《生物制品病毒安全性控制》。对于生物制药行业，这绝对是喜大普奔的好消息。至此，中国药典不仅仅持平国际标准，更在一定程度上超越了目前的国际水平，开始引领法规沿革的大趋势。

在上篇中，高飞博士详细解读了病毒清除验证批次和模型病毒选择等热点话题（请见：2020版中国药典《生物制品病毒安全性控制》解读（上篇）。

本文我们将会聚焦基因治疗病毒安全性控制、色谱法、病毒清除验证关键工艺参数设定和病毒清除新技术等方面进行解读。

新增“基因治疗产品的病毒安全性控制”

《生物制品病毒安全性控制》开篇提出“基因治疗产品的病毒安全性控制”，成为本次药典更新的创新之处。在2020年6月，PDA Virusand TSE Safety Forum 会议上，EMEA的法规专家才开始讨论基因治疗产品的病毒安全性，认为应该在ICH指导原则中添加相应条款。

“基因治疗产品的病毒安全性控制”，特别是针对病毒清除的要求，已经刊印在2020版中国药典里。全世界从事基因治疗产品的生产商，在走向国际市场的时候，都必须遵照中国药典的要求。EMEA和FDA的药典沿革，也需要认真“抄作业“了。

根据药典最新要求：“采用病毒为载体的基因治疗产品，还应建立与病毒载体特性及生产工艺特点相适应的病毒风险评估和控制要求，对非复制型病毒载体生产工艺应关注产生复制型病毒的风险和控制，复制型病毒载体生产应关注产生野生型病毒的风险和控制，生产过程中使用辅助病毒的，应评估和验证生产工艺对辅助病毒的清除能力”。

因为作为基因载体的病毒颗粒，在扩增过程中，具有回复到野生的可能，虽然发生频率极低，但仍然需要高灵敏检测技术来控制风险。

因此，申请进入临床的基因治疗产品，都需要检测具有复制能力的病毒颗粒(Replication competent virus)，具体可包括具有复制能力的：Retrovirus(RCR) 逆转录病毒，Lentivirus (RCL) 慢病毒，AAV (rcAAV) 腺相关病毒，HSV (rcHSV) 疱疹病毒， Adenovirus (RCA) 腺病毒等。

“如可行，应评估病毒载体纯化工艺对相应病毒的清除能力。”这是对基因治疗产品的病毒清除验证提出了要求。与抗体类产品所用指示病毒不同，基因治疗产品需要根据生产细胞系（Producing cells），载体病毒（Vector）或辅助病毒（Supporting virus）来选择。

根据药典要求：“应优先选择与潜在污染病毒密切相关的病毒，如相关病毒不能获取或不适于体外培养（如不能离体培养到足够高的滴度），可采用特异“模型”病毒代替。”

根据默克BioReliance^®测试服务的项目经验，可推荐的指示病毒有：

VSV（Vesicular Stomatitis Virus）作为狂犬病毒和昆虫弹状病毒的模型；
PPV（Porcine Parvovirus）作为人源和牛源细小病毒的模型；
EMC（Encephalomyo-carditis virus）作为人甲型肝炎病毒和小核糖核酸病毒的模型；
AcMNPV（Autographa californica multicapsidnucleopolyhedrovirus）作为昆虫细胞系表达杆状病毒的模型等。

病毒清除验证上，由于基因治疗产品有更多样的下游纯化工艺，更紧迫的纯化周期，验证方案也更具有挑战。但相比于基于CHO发酵的产品，由于不存在基础的内源病毒颗粒数，对“病毒清除下降因子”的要求，也相应较低。

色谱法

“常用的特定病毒清除工艺包括巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂（S/D)处理法、膜过滤法、低pH孵育法、色谱法等。”

此前，根据CDE的指导原则，IND阶段的除病毒验证，重点是验证纯化工艺中包含两步“不同机制的有效去除步骤”，去除/灭活达4logs以上的特定工艺步骤，通常国内申报只需要考察低pH/SD和纳滤两步。

国际申报的惯例，往往还会考察一步层析，由于阴离子流穿模式有较强的病毒去除能力，大多包括低pH/SD，阴离子层析和纳滤三个步骤。除了阴离子层析，在IND阶段也可以考察其他层析步骤的病毒清除能力，这会给BLA阶段的详细验证提供很好的参考价值。

2020新版药典，提到了“色谱法”，可见在国内IND申报中包含层析步骤，已经是大势所趋。但对于层析是否应该达到4logs的清除能力，应该不必苛求，除非是要将层析作为“有效去除步骤”。特别是针对不能加入纳滤的生产工艺，对层析步骤清除能力的要求，也应不少于4logs。

新版药典强调了“色谱法”，CDE指导原则中讲“层析步骤”，都是一个意思，都是英文单词Chromatography的中文翻译，只是在实验室规模上常用“色谱”，生产规模常用“层析”。

明确影响病毒清除效果的

关键工艺参数及控制范围

“应明确影响病毒清除效果的关键工艺参数及控制范围，并在此基础上建立充分的产品制备工艺过程的控制策略。”

除病毒验证的方案，在工艺参数选择上，建议选取最差条件（worst-case condition）。最差条件的选取，仅限于“关键工艺参数”，比如低pH孵育的pH上限和处理时间下限，并不是所有的操作参数都对清除效果有显著的影响。

在IND申报阶段，通常下游工艺还在优化进程中，特别是随着生产规模的放大，最差工艺条件也会不同。对尚在优化中的参数，通常可以选取操作设定值，而不必强求最差工艺条件。在BLA申报阶段，对最差条件有更加严苛的要求，如层析床层高度、线性流速选择、上样量等，都需要选取工艺范围内的最差条件。

如何“影响病毒清除效果的关键工艺参数及控制范围”，此前大多参数的选择，都是基于纯化机理和纯化经验总结而得的，大多都是“纸上谈兵”。新版药典提出了更高要求，已经将“清除效果”提升到关键质量属性（CQA）的水平，在下游工艺的开发与优化过程中，便需要以“清除效果”为目标，进行关键工艺参数（CPP）的优化。

很多生物药物都是基于平台技术，包含很多通用的、模块化的单元操作，如单抗药物的生产工艺，不同产品间的关键工艺参数是可以相互借鉴的。但对于新的产品或工艺中使用了新的技术，如前文所述的基因治疗产品，根据新药典的精神，就不能再通过“纸上谈兵”的方式来确定控制范围了。

采用新技术和新方法

“为提高病毒检出率，应尽可能采用先进的技术和方法用于病毒污染的检测。”

针对病毒污染的检测，传统的方法包括电子显微镜观察、体外细胞培养法、动物抗体生成法。随着今年来生物制药的爆炸式的增长，对检测效率、检测灵敏度的要求不断提升。新的技术，如QPCR（定量聚合酶链反应）技术和NGS（新一代测序技术）不断涌现，检测效率、灵敏度和重复性都明显提升。

由于大量的历史申报都是基于传统检测技术，申请人更倾向于采用稳健的检测方法，而不愿意承担尝试新技术的风险。新版药典提出“应尽可能采用先进的技术和方法”，是对新技术和新方法的积极推广。在疫情当下，鼓励使用新技术和新方法，为相关药品的加速上市，提供了有力的法规依据。

“

拿到2020版药典之后，默克BioReliance^®测试服务团队组织了多次认真学习，向业内专家请教，也多次跟同行一起探讨。在药典研读过程中，也得到专家的指导，得到默克法规与技术专家的支持，在此一并感谢。

”

作者简介

高飞博士

2009年毕业于中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室。现任默克BioReliance®检测服务高级技术专家，为大中华区客户提供专业的技术法规咨询和项目实施方案。高飞博士拥有10年以上的专业经验，曾任GE Fasttrak下游团队经理，中国科学院过程工程研究所，副研究员。

关于默克BioReliance^®检测服务

默克BioReliance^®测试服务是生物制药行业委托服务的领先提供商，为生物药物开发和生产全过程提供合规化质量检测服务。经过70多年的方法学储备和密切法规合作，我们协同遍及全球的四大服务中心，竭诚为您提供适用与生物药物的去病毒验证服务，生物安全测试服务，生物大分子产品表征分析，细胞及基因治疗产品检测，毒理学分析，以及法规技术咨询服务。

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