Ion AmpliSeq农业应用案例 | 武汉市非法水稻种子销售现状调查

种子是农业生产与增产最重要的保障，是农业公司最重要的利润来源。在利益的驱使下，非法销售假冒伪劣种子的现象十分普遍，严重侵犯知识产权和削弱种业创新动力，并造成粮食减产，损害农民权益，危害国家粮食安全等一系列问题。

解决以上问题的根本之道在于从源头上杜绝非法种子的生产与销售。如同人类罪犯身份鉴定和亲子鉴定一样，理论上，精准采集植物品种DNA身份信息并与授权植物品种DNA身份证数据库比对，就可以快速、精确地鉴定植物品种的真实身份，从而鉴别出非法生产与销售行为，监管好种子生产与种业市场，避免上述问题。

SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）是目前植物品种鉴定相关应用（授权、审定、执法与管理等）使用最广的身份信息。例如：利用水稻基因组DNA中48个特定SSR基因座核心序列重复次数的差异进行水稻品种的鉴定，已经写入行业标准（NY/T1433-2014，见下图）。该标准中PCR产物检测方法包括变性、非变性PAGE电泳银染检测，或毛细管电泳荧光检测。待鉴定品种需与参考品种同时检测。当样品间差异位点数≥2，则判定为“不同品种”（还需按GB/T 19557.7的规定进行田间种植确认）；当样品间差异位点数=1，判定为“近似品种”；当样品间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”。

根据这个行业标准，我国已建立了主要农作物SSR 指纹数据库，积累了大量的水稻SSR 指纹图谱。然而，现有SSR标记方法存在标记数量有限、准确度不够、通量低、需要参考品种等不足，即便差异位点数=0，也不能断言是相同品种，还需要田间种植确认（耗时2~3年），无法保证有效和快速区分中国的水稻品种间更紧密的亲缘关系和性状差异。

为解决上述问题，江汉大学依托农业部植物新品种测试中心分子检测实验室（武汉）与农业部联合，开发出了新的中国水稻品种DNA身份证精准采集技术。江汉大学以Thermo Fisher公司的Ion AmpliSeq多重PCR 捕获技术和Ion S5 测序系统为基础，开发了20多项植物品种DNA身份证的精准采集的专利技术AmpSeq-SSR，相关文章发表在国际知名的期刊《Nucleic Acids Research》（2017, 45(10): e88）上。利用AmpSeq-SSR技术，该单位精准且完整地建立了中国授权水稻品种的DNA身份证数据库。

AmpSeq-SSR技术的核心之一是利用Ion AmpliSeq多重PCR技术，靶向扩增中国所有6000 余个授权水稻品种基因组DNA中高多态性、均匀分布的SSR（Simple Sequence Repeat）遗传标记序列（包括农业行业标准NY/T1433-2014采用的48个位点），然后，利用二代测序对检测捕获的序列进行高通量测序，获得其中的SSR序列和分型信息（技术流程见下图）。相对于传统的电泳、一代测序片段分析技术只对48个特定SSR位点的分析来说，AmpSeq-SSR技术对于种质来源的分辨率提高了数个数量级，能够方便、快速的辨别出种子市场中的李逵和李鬼。

相比现有方法，AmpSeq-SSR技术的优势有以下几点：

1、高通量——可以同时检测SSR标记的数量超过3000个，而且有向上扩展的空间，有效保证了品种鉴定的分辨率。不仅如此，还可以实现多达上百个样本的同时检测。

2、高准确度和分辨率——具体表现在：

（1）通过了一代测序（金标准）的验证（下图 A，序列一致和准确）；（2）准确度与分辨率都极显著地高于传统的琼脂糖电泳、PAGE胶电泳和毛细管电泳（下图3 B，凝胶电泳检测无法通过条带大小区分(TC)9和(TC)10间2 bp的长度差异；下图3 C和D，PAGE胶电泳无法区分同一SSR位点、相同长度PCR产物中的序列差异或SSR分型差异；下图3 E，AmpSeq-SSR技术测得的序列长度准确率更高，滑脱率比毛细管电泳更低），绝对准确性与重现性均接近100%（表1）

3、在检测成本、速度等方面显著优于现有方法（详见表2）。

AmpSeq-SSR分型技术与传统的SSR分型技术的比较

A：AmpSeq-SSR技术与一代测序结果是一致的；B：琼脂糖胶无法显示AmpSeq-SSR技术检测到的差异；C-D：PAGE胶无法显示AmpSeq-SSR技术检测到的差异；E：AmpSeq-SSR技术优于毛细管电泳技术

表1 AmpliSeq-SSR技术方法的准确率

表2 AmpSeq-SSR技术方法与现有其他方法比较

（以完成3000个SSR位点分型任务为例）

江汉大学利用AmpSeq-SSR技术，已将我国授权水稻品种中的1700个亲本材料使用以上精选的SSR和MNP（Multiple Nucleotide Polymorphism多核苷酸多态性）遗传标记位点分型建立了高精度数据库。未来，期望依托该类数据库和AmpSeq-SSR技术，建立起精准和快速的水稻乃至更多作物品种的授权、审定、执法与管理新标准。

最后，本案例充分体现了AmpSeq-SSR技术在水稻品种相关应用（授权、审定、执法与管理）上的高通量、高准确度和分辨率、低成本、快速和不需要参考品种的优势，是Ion AmpliSeq技术和二代测序技术在农业领域应用的最新成果。而且，作为一种通用的技术方法，AmpSeq-SSR技术不仅限于SSR标记开发和水稻品种的鉴定，还可以用于其他植物、动物或微生物相关的物种鉴定、进化分析、分子育种、遗传标记开发等应用。

延伸阅读（遗传标记个体识别小知识）

SSR，即简单重复序列（Simple Sequence Repeat），是真核生物中一种非常重要的DNA遗传标记。在人类基因组中，对应的概念为STR（即短串联重复，Short Tandem Repeat）或微卫星DNA（microsatellite DNA）。它们都是指以少数几个核苷酸（多数为2-6个）为核心序列（motif）多次串联重复行成的DNA序列。例如：核心序列AGAT重复4次形成的STR或SSR是AGATAGATAGATAGAT。由于核心序列和重复次数的不同，STR具有高度多态性。STR按孟德尔规律呈共显性遗传，绝大多数不受选择压力的影响，具有种属特异性，较均匀的分布于人类全基因组和真核生物中。联合多个STR位点的多态性信息，可以帮助实现精准的个体识别，有效位点数目越多，分辨率就越高。

STR位点的多态性具有个体特异性

STR或SSR在人类基因组遗传图谱的制作，亲缘关系分析，法医学个体识别和亲权鉴定，器官移植，种质鉴定，分子育种，基因定位等领域都得到了广泛的应用。

下面亲子鉴定和个体识别为例，简单介绍下STR/SSR分型应用的简单原理（见下图）。首先，通过STR或SSR两侧的保守序列设计引物，对单个或多个STR或SSR位点进行扩增（多个位点的多重PCR扩增，可通过使用几种荧光标记来区分），然后，利用电泳技术（如毛细管电泳、凝胶电泳等）对STR或SSR各个相应位点的扩增产物片段进行长度多态性分析，再与待查/参考样本或数据库进行比对，数据分析，可以达到亲缘关系鉴定或个体识别的目的。具体到亲子鉴定应用上，在没有基因突变和分型错误的前提下，孩子的一对等位基因必定一个来自父亲，一个来自母亲；孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。例如：某案例中母亲D5S818基因座是10/12型，孩子为10/14型，从比较中可确定生父基因具有D5S818-14型。假设父1为D5S818-10/10型，假设父2为D5S818-13/14型。其中假设父1不具备生父基因型14，故可排除他与孩子的亲生关系；相比之下，假设父2因具有D5S818-14，不排除与孩子有亲生关系。

目前，商业化的STR分型试剂盒结合毛细管电泳荧光检测技术（如Applied Biosystems 3500系列遗传分析仪），通过十几到二十多个基因座分型（如ThermoFisher华夏白金试剂盒包含23个常染色体STR基因座和两个性别标记基因座），可实现几乎100%的亲缘关系鉴定准确率。

PCR-STR分型用于亲子鉴定原理示意图

图上凝胶电泳STR位点条带仅供示意说明，现在多采用毛细管电泳技术进行分析

PCR-STR分型用于嫌疑人的个体识别原理示意图

图上凝胶电泳STR位点条带仅供示意说明，现在多采用毛细管电泳技术进行分析