qPCR实验前的这些注意事项您留意了吗？

模板制备

在我们进行qPCR实验时，需要根据所用试剂盒说明书加入适量的起始核酸模板，过多的模板可能提高污染物含量，大大降低 PCR 效率，过少的模板可能会降低检测灵敏性和重复性。

另一方面，如果我们检测的模板类型是cDNA，那么纯的完整 RNA 是高质量全长 cDNA 合成的基础，也是实现准确定量的关键。所以在RNA准备过程中为了避免模板降解，要格外注意避免过度的热处理样品，异常的紫外照射，RNA 酶的污染等。有研究工作使用不同时间长度热处理（80℃高温处理）RNA样本，随后以oligo dT作为反转录引物完成反转录得到cDNA模板，最后针对目标基因的5’ 端和3’ 端分别设计引物，比较相同靶标不同检测位点Cq值的差异[ΔCq=Cq(5’ targeted)- Cq(3’ targeted)]，用以评估模板完整性对定量结果的影响。如下图所示，随着热处理时间的延长，RNA模板降解程度越严重（图1b），所检测的6个靶标均表现出ΔCq随处理时间增大的现象（图1a）。可见为了获得准确的定量结果，保证模板完整的重要性。

图1 不同时间热处理样本对qPCR定量结果的影响

(a) 和模板降解程度评估(b)

Jo Vandesompele, et al,. Nucleic Acids Research, 2011

其次根据检测靶标的性质特点，选择合适的核酸抽提试剂盒同样至关重要。小编有遇到老师想要通过qPCR的方法完成对microRNA的定量，但是发现待检测样本中目标microRNA和内参基因的扩增曲线出峰时间都比较晚，内参基因的Ct值甚至大于30（图2）。排除实验操作问题后发现原来是因为所使用RNA抽提试剂盒对小片段的microRNA回收效率低，不适合用于下游microRNA定量实验。

图2 内参基因扩增曲线

从上面两个例子可以发现选择合适的核酸抽提试剂盒得到高质量的模板，是qPCR定量准确的关键因素之一。

引物探针的设计及储存

除了要保证模板的质量外，引物探针的设计和稳定性同样至关重要。当我们根据检测靶标设计特异性引物和探针时，除了要考虑片段长度，Tm值，碱基组成等基本要点外，还需格外注意引物，探针自身不能形成复杂的二级结构，上下游引物内部，引物探针之间不能出现结合的现象，因为这些都可能影响引物探针与目标基因的结合，进而影响最终的扩增效率。

如下面示例，小编接到老师反映使用SYBR Green染料法进行定量实验，发现阳性样本扩增曲线Ct值偏大，且熔解曲线有双峰（图3a），进一步查看无模板对照孔发现该孔同样有扩增信号，熔解曲线有Tm=75℃的小峰，且该峰的位置与阳性样本孔熔解曲线前面小峰位置相对应（图3b）。通过这样的结果推测在该实验中可能是因为引物二聚体的问题导致阳性样本扩增曲线Ct值偏大的现象，可以通过提高退火温度，降低引物浓度或重新设计引物来解决该问题。

图3 阳性样本孔扩增曲线Ct值大且熔解曲线有双峰（a）无模板对照孔有扩增且熔解曲线有单峰（b）

除了引物探针在设计时需要格外花费心思外，收到合成好的引物、探针如何稀释，如何保存同样有小tips。如果我们合成的引物探针是干粉状或是需要稀释时，为了保证引物探针的稳定性建议用1×TE buffer去溶解和稀释。另外，引物的储存浓度也可能影响其稳定性，建议引物的储存浓度不低于 10 μM，一般为100 μM 。此外如果引物和探针每次使用量较少时，还应该进行分装，保存在-20℃，以减少反复冻融的次数。

如下示例，有老师用SYBR Green染料法进行实验发现多个阳性对照的多组分图均没有扩增信号（图4），更换预混液和模板后依然没有扩增，经沟通发现老师在实验中使用的引物储存浓度为20 pM，使用新合成的引物后实验结果正常。推断引物在长期储存时因保存浓度过低，性质不稳定发生了降解。

图4 阳性对照无扩增

扩增试剂选择

当我们准备好模板和引物探针，接下来需要面对的问题就是：哪款扩增试剂适合我们的实验所需呢？当前市面上扩增试剂千千万，如何才能实现双向奔赴呢？这里就不得不强烈向大家推荐我们实时荧光定量 PCR 预混液选择工具了（链接：https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-reagents.html），通过在线点点点即可轻松找到您心仪的预混液啦（图5）。

图5 实时荧光定量 PCR 预混液选择工具

不管是TaqMan探针法还是SYBR Green染料法，不管是一步法还是两步法试剂，不管是单重检测还是多重检测，不管是基因表达还是基因分型实验，亦或是microRNA检测，蛋白热稳定性实验等，总有一款预混液能够满足您的需求（图6）。

图6 qPCR预混液选择向导

耗材选择和使用规范

到这里我们已经介绍完了装配qPCR体系三要素的注意事项，最后在承载我们反应体系的耗材选择上同样不能掉以轻心。首先，为了保证结果的稳定性和准确性，不管是8联管，96孔板还是384孔板，我们都建议大家使用qPCR仪器官方手册推荐的耗材。其次在挑选前需确认好仪器的加热模块类型，比如当我们使用的仪器加热模块是96-well 0.2 mL的话，就一定不能错误使用96-well 0.1 mL的耗材，不然会因为96孔板和加热模块贴合不紧密，引起温度控制不准确，最终导致扩增结果异常，如图7所示。更多因耗材选择错误而导致的扩增曲线异常现象，可参考之前的文章《荧光定量PCR异常扩增曲线分析攻略》。

图7 耗材与仪器不匹配导致扩增结果异常

当我们挑选对了合适的耗材，装配好了qPCR反应体系后，在上机时还需要注意以下事宜。第一，如果您使用的是我们Applied Biosystems™系列的荧光定量PCR仪器，请一定不要在8联管管盖，96或384孔板的封板膜上做标记，它们会影响信号的采集进而导致扩增结果的异常，另外管壁同样不建议做记号，因为这会产生加热模块污染的可能性。第二，在将我们的耗材向仪器上放置时，跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确，比如7500配套的8联管托架是黑色，四周带海绵样式的（图8a），如果不放置托架，直接将8联管放置在加热模块上，或使用错误的托架，可能会导致扩增曲线打折的现象（图8b）。具体Applied Biosystems™系列的荧光定量PCR仪器配件对应使用情况，可参考之前的文章《贴士：正确使用荧光定量仪器配件和耗材（更新版）》。

图8 7500仪器8联管托架（a）不放置8联管托架导致扩增曲线异常

第三，当我们检测样本量较少，选择使用8联管开展实验时，除了要注意使用对应的配件外，8联管在加热模块上的放置位置同样有讲究。如下图所示，当我们8联管数目较少时需将样本管纵向放置在加热模块的中间部位，左右边缘两列放置空管作为平衡，保证热盖下压时受力均匀（图9）。

图9 8联管放置位置要求

综上，我们梳理了qPCR实验前需要注意的几个要点问题，有没有发现这可比把大象放冰箱复杂多了呢。不过不用担心，如果上面提到注意事项您仍有不清楚的地方，请不要犹豫，我们技术支持团队期待和您的讨论交流。