J Agric Food Chem | 靶向HILIC-ESI-MS/MS高通量分析婴儿血清中未衍生氨基酸和酰基肉碱

2023-07-18 15:40:36, 质谱创新组学 上海欧易生物医学科技有限公司



01
研究背景


氨基酸(AAs)和酰基肉碱(ACs)是机体能量状态的重要生物标志物,对人体能量代谢至关重要。在常规临床诊断中,特别是在新生儿筛查中,AA和AC可作为先天性代谢缺陷的诊断标志物。然而,针对这些化合物的血清高通量分析的多分析方法很少,适用于幼儿和婴儿的微量分析方法缺乏。


02
前言


2023年7月8日,德国慕尼黑工业大学Corinna Dawid教授与Thomas F. Hofmann教授团队在知名期刊J Agric Food Chem(IF=6.1,中科院农林科学1区)上发表了题为“High-Throughput Analysis of Underivatized Amino Acids and Acylcarnitines in Infant Serum: A Micromethod Based on Stable Isotope Dilution Targeted HILIC-ESI-MS/MS”的最新研究成果,该研究开发并验证了一种高通量HILIC-MRM-MS/MS方法,用于快速定量人血清中未分级的AA、AA衍生物和AC,提供了AA和AC代谢的广泛分析以及定量代谢物数据。并且首次将该方法应用于145个3-4个月月龄的健康婴儿的血清样本,结果显示出多日分析的良好再现性,并能够同时在该年龄组中进行氨基酸和酰基肉碱谱分析。



03
研究思路



这项研究通过对LC-MS/MS技术进行探究,开发出一种针对AAs和ACs的新的靶向HILIC-ESI-MS/MS方法,能够对人血清中的62种AA和AC代谢物进行高通量分析,并解决了婴幼儿血清高通量分析的技术难题。


04
研究方法


仪器:

Exion UHPLC系统 (Sciex, Darmstadt, Germany)

QTRAP 6500+ 质谱仪 (Sciex, Darmstadt, Germany)


色谱质谱参数:


实验材料:

1. 血清材料(ERNDIM, MCA Laboratory, Winterswijk, the Netherlands; product codes: AMI-02.1, AMI-02.2, CAR-02.1);


2. 婴儿血清样品:145份健康的3-4个月月龄的婴儿((n = 145, age: 3.9 ± 0.5月, nfemale= 76, nmale = 69)的血清样本。


研究技术:

靶向LC-MS/MS(Hilic)定量检测技术


05
研究结果


研究者建立了一种新的靶向LC-MS/MS方法,高通量分析人血清中62种AAs和ACs代谢物,生成快速定量的AA和AC代谢能量代谢指纹图谱。验证后,该方法应用于145份3-4个月月龄婴儿的血清样本。


1. 方法开发


通过用甲醇处理血清样品,将高效的分析物提取和综合蛋白沉淀结合。在BEH酰胺柱上同时分离提取的AAs、AA衍生物和ACs,为所有不同极性的化合物提供了有效的分辨率(图1)和良好的峰形。开发的UHPLC方法能够分离几种同量异位化合物,例如Leu [ID 10]/Ile [ID 9]/Cre[ID 30]/Hyp [ID 22] (图2)。此外,在样品检查过程中总共添加了39种同位素或同位素标记的标准品,称为稳定同位素内标分析(SIDA),以减少检查过程中关于电离行为和基质干扰的误差。

图1. UHPLC-MRM-MS/MS色谱参考标准混合洗脱顺序在贝酰胺柱氨基酸和氨基酸衍生物(n = 40)和酰基肉碱(n = 22)超过13 min,其次是冲洗和再平衡(未显示),总运行时间为20 min。


图2. 混合婴儿血清样本中同量异位化合物的分离


2. 方法验证


在将UHPLC-MRMMS/MS方法应用于婴儿样本之前,该方法根据美国食品和药物管理局(FDA)指南进行了分析程序和方法验证,该方法的性能和验证参数如表1所示。


基于加权的线性回归模型(1/x;表1),在规定的校准范围内,几乎所有分析物的校准曲线达到确定系数(R2)>0.99。并测定了LOD和LOQ。三次重复的LOQ的准确性在88.2-119.7%之间,所有分析物的精密度(%CV)均低于14%。


表1. 线性范围(LR)、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、确定系数(R2)、LOQ的精度(%CV)和具有标准偏差(SD)的精度(%RE)


通过比较存在和不存在基质时的校准实验,发现无论矩阵是否存在,校准系列的斜率都很相似。然而,由于血清中天然代谢物含量的不同(图3A,B),这表明不需要考虑基质效应。并且基于图3结果,在溶剂中进行了精确定量的校准系列。

 

图3. 矩阵效果


该方法的精度(表2)涵盖了样品制备(五次重复)和UHPLC-MS/ MS测量的可变性。通过冻融稳定性测试,在所有QC水平上,浓度的变化没有观察到交叉分析的趋势,表明没有严重的冻融效应,再次验证了该方法及其分析的代谢物的稳定性(表2)。


表2. 日内(d=1)和日间(d=3;个体)准确度(%RE)和精密度(%CV),以及冻融稳定性([0 h]前和三个周期[72 h]后的±百分比变化)

 

3. 方法在3-4月龄婴儿血清中的应用


将开发的UHPLC-MS/MS方法应用于3-4月龄的婴儿的血清样本,以证明其适用性。本文测定了54种分析物的定量图谱(图4),显示其浓度高于LOQ,并且至少存在于60%的样品中。


通过PCA检测孔板、批次和采集日的潜在影响,发现PCA评分图(图5A)显示了所有合并QCs的不同聚类。目视检查未观察到由孔板(图5B)或采集日(图5C)引起的聚集。因此,排除了技术变异性,再次确认了所开发方法的重现性。由于少数样本显示了弱(H1)和强(H2)溶血,因此我们以溶血分级作为一个感兴趣的变量进行了PCA分析(图5D)。溶血没有收到明显的聚集,这表明对测量的代谢物的影响可以忽略不计。


图4. 3-4个月月龄的婴儿血清中AAs

AA衍生物和ACs的浓度[μM](n=145)测定

图5. 婴儿血清样本组的PCA评分图


06
研究结论


1. 开发并验证了一种高通量HILIC-MRM-MS/MS方法,用于快速定量人血清中未充分利用的AAs、AA衍生物和ACs,能够在20分钟的运行时间内同时检测62种代谢物。该方法提供了广泛的AA和AC代谢图谱以及定量代谢物数据。


2. 首次使用高通量、无衍生化和共高效的UHPLC-MRM-MS/MS测定3-4个月月龄的健康婴儿血清中AA和AC浓度。


3. 该方法在多日的测量期间显示出良好的重现性和无技术变异性,允许大样本量的AA和AC代谢的个体图谱。


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本文开发并验证了一种高通量、无衍生化的HILIC-MRM-MS/MS方法来快速定量3-4月龄婴儿血清中的AAs和ACs, 为靶向氨基酸代谢领域提供理论基础


参考文献 

1. Wudy SI, Mittermeier-Klessinger VK, Dunkel A, Kleigrewe K, Ensenauer R, Dawid C, Hofmann TF. High-Throughput Analysis of Underivatized Amino Acids and Acylcarnitines in Infant Serum: A Micromethod Based on Stable Isotope Dilution Targeted HILIC-ESI-MS/MS. J Agric Food Chem. 2023 Jun 7;71(22):8633-8647. doi: 10.1021/acs.jafc.3c00962. Epub 2023 May 26. PMID: 37232935.


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文末看点lumingbio


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西野 撰文

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