J Agric Food Chem | 靶向HILIC-ESI-MS/MS高通量分析婴儿血清中未衍生氨基酸和酰基肉碱

2023-07-18 15:40:36, 质谱创新组学上海欧易生物医学科技有限公司

研究背景

氨基酸（AAs）和酰基肉碱（ACs）是机体能量状态的重要生物标志物，对人体能量代谢至关重要。在常规临床诊断中，特别是在新生儿筛查中，AA和AC可作为先天性代谢缺陷的诊断标志物。然而，针对这些化合物的血清高通量分析的多分析方法很少，适用于幼儿和婴儿的微量分析方法缺乏。

前言

2023年7月8日，德国慕尼黑工业大学Corinna Dawid教授与Thomas F. Hofmann教授团队在知名期刊J Agric Food Chem（IF=6.1，中科院农林科学1区)上发表了题为“High-Throughput Analysis of Underivatized Amino Acids and Acylcarnitines in Infant Serum: A Micromethod Based on Stable Isotope Dilution Targeted HILIC-ESI-MS/MS”的最新研究成果，该研究开发并验证了一种高通量HILIC-MRM-MS/MS方法，用于快速定量人血清中未分级的AA、AA衍生物和AC，提供了AA和AC代谢的广泛分析以及定量代谢物数据。并且首次将该方法应用于145个3-4个月月龄的健康婴儿的血清样本，结果显示出多日分析的良好再现性，并能够同时在该年龄组中进行氨基酸和酰基肉碱谱分析。

研究思路

这项研究通过对LC-MS/MS技术进行探究，开发出一种针对AAs和ACs的新的靶向HILIC-ESI-MS/MS方法，能够对人血清中的62种AA和AC代谢物进行高通量分析，并解决了婴幼儿血清高通量分析的技术难题。

研究方法

仪器：

Exion UHPLC系统 (Sciex, Darmstadt, Germany)

QTRAP 6500+ 质谱仪 (Sciex, Darmstadt, Germany)

色谱质谱参数:

实验材料：

1. 血清材料（ERNDIM, MCA Laboratory, Winterswijk, the Netherlands; product codes: AMI-02.1, AMI-02.2, CAR-02.1）;

2. 婴儿血清样品：145份健康的3-4个月月龄的婴儿（(n = 145, age: 3.9 ± 0.5月, nfemale= 76, nmale = 69）的血清样本。

研究技术:

靶向LC-MS/MS（Hilic）定量检测技术

研究结果

研究者建立了一种新的靶向LC-MS/MS方法，高通量分析人血清中62种AAs和ACs代谢物，生成快速定量的AA和AC代谢能量代谢指纹图谱。验证后，该方法应用于145份3-4个月月龄婴儿的血清样本。

1. 方法开发

通过用甲醇处理血清样品，将高效的分析物提取和综合蛋白沉淀结合。在BEH酰胺柱上同时分离提取的AAs、AA衍生物和ACs，为所有不同极性的化合物提供了有效的分辨率（图1）和良好的峰形。开发的UHPLC方法能够分离几种同量异位化合物，例如Leu [ID 10]/Ile [ID 9]/Cre[ID 30]/Hyp [ID 22] （图2）。此外，在样品检查过程中总共添加了39种同位素或同位素标记的标准品，称为稳定同位素内标分析（SIDA），以减少检查过程中关于电离行为和基质干扰的误差。

图1. UHPLC-MRM-MS/MS色谱参考标准混合洗脱顺序在贝酰胺柱氨基酸和氨基酸衍生物（n = 40）和酰基肉碱（n = 22）超过13 min，其次是冲洗和再平衡（未显示），总运行时间为20 min。

图2. 混合婴儿血清样本中同量异位化合物的分离

2. 方法验证

在将UHPLC-MRMMS/MS方法应用于婴儿样本之前，该方法根据美国食品和药物管理局（FDA）指南进行了分析程序和方法验证，该方法的性能和验证参数如表1所示。

基于加权的线性回归模型(1/x；表1），在规定的校准范围内，几乎所有分析物的校准曲线达到确定系数（R2）>0.99。并测定了LOD和LOQ。三次重复的LOQ的准确性在88.2-119.7%之间，所有分析物的精密度（%CV）均低于14%。

表1. 线性范围（LR）、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、确定系数（R2）、LOQ的精度（%CV）和具有标准偏差（SD）的精度（%RE）

通过比较存在和不存在基质时的校准实验，发现无论矩阵是否存在，校准系列的斜率都很相似。然而，由于血清中天然代谢物含量的不同（图3A，B），这表明不需要考虑基质效应。并且基于图3结果，在溶剂中进行了精确定量的校准系列。

图3. 矩阵效果

该方法的精度（表2）涵盖了样品制备（五次重复）和UHPLC-MS/ MS测量的可变性。通过冻融稳定性测试，在所有QC水平上，浓度的变化没有观察到交叉分析的趋势，表明没有严重的冻融效应，再次验证了该方法及其分析的代谢物的稳定性（表2）。

表2. 日内（d=1）和日间（d=3；个体）准确度（%RE）和精密度（%CV），以及冻融稳定性（[0 h]前和三个周期[72 h]后的±百分比变化）

3. 方法在3-4月龄婴儿血清中的应用

将开发的UHPLC-MS/MS方法应用于3-4月龄的婴儿的血清样本，以证明其适用性。本文测定了54种分析物的定量图谱（图4），显示其浓度高于LOQ，并且至少存在于60%的样品中。

通过PCA检测孔板、批次和采集日的潜在影响，发现PCA评分图（图5A）显示了所有合并QCs的不同聚类。目视检查未观察到由孔板（图5B)或采集日（图5C)引起的聚集。因此，排除了技术变异性，再次确认了所开发方法的重现性。由于少数样本显示了弱（H1）和强（H2）溶血，因此我们以溶血分级作为一个感兴趣的变量进行了PCA分析（图5D）。溶血没有收到明显的聚集，这表明对测量的代谢物的影响可以忽略不计。

图4. 3-4个月月龄的婴儿血清中AAs

AA衍生物和ACs的浓度[μM]（n=145）测定

图5. 婴儿血清样本组的PCA评分图

研究结论

1. 开发并验证了一种高通量HILIC-MRM-MS/MS方法，用于快速定量人血清中未充分利用的AAs、AA衍生物和ACs，能够在20分钟的运行时间内同时检测62种代谢物。该方法提供了广泛的AA和AC代谢图谱以及定量代谢物数据。

2. 首次使用高通量、无衍生化和共高效的UHPLC-MRM-MS/MS测定3-4个月月龄的健康婴儿血清中AA和AC浓度。

3. 该方法在多日的测量期间显示出良好的重现性和无技术变异性，允许大样本量的AA和AC代谢的个体图谱。

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本文开发并验证了一种高通量、无衍生化的HILIC-MRM-MS/MS方法来快速定量3-4月龄婴儿血清中的AAs和ACs，为靶向氨基酸代谢领域提供理论基础。

参考文献

1. Wudy SI, Mittermeier-Klessinger VK, Dunkel A, Kleigrewe K, Ensenauer R, Dawid C, Hofmann TF. High-Throughput Analysis of Underivatized Amino Acids and Acylcarnitines in Infant Serum: A Micromethod Based on Stable Isotope Dilution Targeted HILIC-ESI-MS/MS. J Agric Food Chem. 2023 Jun 7;71(22):8633-8647. doi: 10.1021/acs.jafc.3c00962. Epub 2023 May 26. PMID: 37232935.

文末看点｜lumingbio

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