2023-02-21 12:31:23, 陈李洋 赛默飞世尔科技生命科学产品
在荧光定量PCR实验中,相对定量方法适用于大多数基因表达研究。这种定量方法以稳定表达的内参基因作为参照,用于分析实验样本间目的基因表达水平变化。由于实验设置简单,比较Ct法是相对定量实验中最常用的方法,实验结束后,利用2-△△Ct算法即可对相对表达结果进行计算。在平时的交流沟通中,我们了解到,有些用户利用qPCR软件得到Ct值后,会手动进行相对定量的计算。其实,ABI的各种机型搭配实验软件,均可以直接给出相对定量的计算结果,这些结果与手动计算的结果是一致的,可以免去手动计算的过程。
今天我们利用ABI荧光定量软件中比较Ct法的Sample数据,帮大家梳理一下比较Ct法的计算流程,帮助大家消除对软件结果使用的疑虑。
一
比较Ct法的基本原理
我们先来回顾一下比较Ct法的基本原理,这个方法最早是KJ Livak(Applied Biosystems)在2001年发表的文章中提出的。我们将推导过程列在下图,感兴趣的小伙伴可以查看原文[1]。
图1.比较Ct法相对定量的推导过程
需要注意的是,靶基因与内参基因的扩增效率一致,且接近于100%,是使用比较Ct法的前提。
二
比较Ct法相对定量结果计算
理解了原理之后,我们来看具体计算过程。在比较Ct法相对定量的实验中,我们建议对于每个样本,内参基因及目的基因都设置至少三个技术重复,以满足实验的统计学要求。根据比较Ct法的原理,我们对每个样品分别计算出目的基因(GOI, Gene of Interest)及内参基因(Normalizer)的Ct均值,再将目的基因的Ct均值减去内参基因的Ct均值,即得到对于该样品的ΔCt值。再将待测样品的ΔCt值减去对照样品的ΔCt值,得到最后用于计算相对表达的ΔΔCt值,公式如下:
了解了计算过程后,我们以QuantStudio 5荧光定量系统中的比较Ct法相对定量数据为例,利用QuantStudio Design&Analysis Desktop Software来演示上述计算过程。
图2.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software中相对定量Sample数据扩增曲线
将Ct值整理至下表。这里指定样品400为对照样本,基因IPC为内参基因。
表1.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software中相对定量Sample数据Ct值整理
我们按照公式进行手动计算,首先依次计算三个样本中内参基因IPC及目的基因RNaseP的Ct均值,进而算得每个样本的ΔCt值。
表2.相对定量Sample数据各样本ΔCt值的计算
接下来根据得到的每个样本的ΔCt值,以样本400为对照样本,可以得到样本1600的ΔΔCt=(-2.363)-(-0.489)=-1.874,样品800样本的ΔΔCt=(-1.255)-(-0.489)=-0.766。最后利用2-△△Ct算法,得到每个样本中RNaseP基因相对于样本400的表达量如下表。
表3.相对定量Sample数据各样本ΔΔCt值及相对表达量的计算
那么如果用软件直接计算,得出结果是什么呢?我们可以在Results界面下切换至Gene Expression选项,查看比较Ct法相对定量的结果。
图3.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software中Sample数据相对定量结果的计算
可以看到软件的计算结果与手动计算的结果是一致的,并且可以找到计算过程中的中间量,如µ(Ct),各样本的ΔCt值及ΔΔCt值。
三
相对定量上下限(RQ min and RQ max)的计算
由于实验设置了重复,我们还需要对相对定量值添加上下限,定量PCR软件对上下限的计算给出了两种算法。默认的算法是置信区间算法(Confidence Level Algorithm),这种算法基于实验中Ct值的统计学分布进行的区间估计。另一种可供选择的方法是基于标准差的算法(Standard Deviation Algorithm),这种方法计算相对简单,只需要计算出ΔΔCt的标准差值,是早期相对定量分析中提出的算法(KJ Livak,& TD Schmittgen, 2001)。我们分别来看这两种方法的计算上下限的过程。
首先来看置信区间算法,这里还是以刚才用到的比较Ct相对定量数据为例。该方法的细节推导详见文末的参考文献[2],这里只展示计算的过程。
首先我们需要分别对每个样本中的目的基因和内参基因的Ct值都计算标准差,计算公式如下:
对每个样本,利用计算得到的目的基因和内参基因的标准差,进一步计算ΔCt的标准误差(ΔCtSE),公式如下:
其中,n1和n2是每个样本中靶基因和内参基因的复孔数目。
计算过程还需要用到给定置信区间下的t值,在靶基因与内参基因的复孔数均大于2的情况下,可以通过下式计算自由度:
-ΔΔCt置信水平为1-α的置信区间为
- ΔΔCt±tα/2(ν(ΔCt))× ΔCt SE
以常用的置信水平95%为例,对于本例中的样本,靶基因与内参基因的复孔数均为3,自由度即为ν(ΔCt)=3+3-2=4,需要计算t0.05/2(4),可在Excel中由公式TINV(0.05, 4)给出,为2.776。依次计算上述各数值,最后得到RQ Min和RQ Max整理至下表:
表4.置信区间法相对定量上下限结果计算
在软件中,查看基于置信区间的上下限结果,可以看到,计算结果与上述计算一致。
图4.软件中置信区间法相对定量上下限结果计算
接下来是基于ΔΔCt的标准差的上下限计算。上述计算中,我们已经完成了每个样本中内参基因与目的基因的标准差计算。对于每个样本,由于ΔCt的计算需要同时用到目的基因和内参基因Ct值的均值,其标准差需要把内参基因和目的基因Ct的标准差同时考虑进来,这里以样本800为例,按下式计算:
计算ΔΔCt值时,由于直接使用了对照样品的ΔCt,认为其为一个固定数值,故认为对于单个实验样本,其ΔΔCt的标准差与ΔCt的标准差相等,如对样本800,有:
根据计算结果,对于每个样品,ΔΔCt值正负一个标准差值作为其上下限。以样品800为例,ΔΔCt,800为-0.766, 标准差为0.059,ΔΔCt,800的上下限为-0.766±0.059,可得到上限RQ Max对应的ΔΔCt值为-0.825,下限RQ Min对应的ΔΔCt为-0.707。利用2-ΔΔCt算法,算得RQ Max为1.771,RQ Min为1.632。利用相似的计算过程,可以完成对样品400及样本1600中RQ Max和RQ Min的计算,计算结果如下表:
表5.基于标准差的相对定量上下限结果计算
若在软件中查看这种算法的上下限结果,我们可以查看Analysis->Analysis Settings->Relative Quantification Settings下的RQ Min/Max Calculations选项,并将默认的Confidence Level选项改为Standard Deviations,上下限默认一个标准差,勾选1,如下图所示:
图5.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software相对定量设置
回到Results界面下Relative Expression选项,查看软件给出的结果,上下限的计算结果与上述手动计算的结果一致。
图6.软件中基于标准差的相对定量上下限结果计算
小结
通过今天的文章,我们帮大家梳理了比较Ct法进行相对定量实验的原理以及计算方法。可以看到,根据指定的内参基因及对照样本,不管是基因表达相对定量值还是其上下限,软件给出的计算结果与文献中提出的计算方法都是一致的,因此无需再进行复杂的手动计算。在平时的实验中,只需在软件中正确设置对照样本与内参基因,即可直接使用软件给出的结果,用于后续的数据分析及作图。
参考文献:
1. Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method. methods, 25(4), 402-408.
2. User Bulletin: Applied Biosystems Real-Time PCR Systems - Relative Quantification (RQ) Algorithms in Applied Biosystems Real-Time PCR Systems Software. July 2007, Part Number 4378622.
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