还在手动计算吗？|相对定量（比较Ct法）实验计算介绍

比较C_t法的基本原理

我们先来回顾一下比较C_t法的基本原理，这个方法最早是KJ Livak（Applied Biosystems）在2001年发表的文章中提出的。我们将推导过程列在下图，感兴趣的小伙伴可以查看原文^[1]。

图1.比较C_t法相对定量的推导过程

需要注意的是，靶基因与内参基因的扩增效率一致，且接近于100%，是使用比较C_t法的前提。

比较C_t法相对定量结果计算

理解了原理之后，我们来看具体计算过程。在比较C_t法相对定量的实验中，我们建议对于每个样本，内参基因及目的基因都设置至少三个技术重复，以满足实验的统计学要求。根据比较C_t法的原理，我们对每个样品分别计算出目的基因(GOI, Gene of Interest)及内参基因(Normalizer)的C_t均值，再将目的基因的C_t均值减去内参基因的C_t均值，即得到对于该样品的ΔC_t值。再将待测样品的ΔC_t值减去对照样品的ΔC_t值，得到最后用于计算相对表达的ΔΔC_t值，公式如下：

了解了计算过程后，我们以QuantStudio 5荧光定量系统中的比较C_t法相对定量数据为例，利用QuantStudio Design&Analysis Desktop Software来演示上述计算过程。

图2.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software中相对定量Sample数据扩增曲线

将Ct值整理至下表。这里指定样品400为对照样本，基因IPC为内参基因。

表1.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software中相对定量Sample数据C_t值整理

我们按照公式进行手动计算，首先依次计算三个样本中内参基因IPC及目的基因RNaseP的C_t均值，进而算得每个样本的ΔC_t值。

表2.相对定量Sample数据各样本ΔC_t值的计算

接下来根据得到的每个样本的ΔC_t值，以样本400为对照样本，可以得到样本1600的ΔΔC_t=(-2.363)-(-0.489)=-1.874，样品800样本的ΔΔC_t=(-1.255)-(-0.489)=-0.766。最后利用2^-△△C_t算法，得到每个样本中RNaseP基因相对于样本400的表达量如下表。

表3.相对定量Sample数据各样本ΔΔC_t值及相对表达量的计算

那么如果用软件直接计算，得出结果是什么呢？我们可以在Results界面下切换至Gene Expression选项，查看比较C_t法相对定量的结果。

图3.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software中Sample数据相对定量结果的计算

可以看到软件的计算结果与手动计算的结果是一致的，并且可以找到计算过程中的中间量，如µ(C_t)，各样本的ΔC_t值及ΔΔC_t值。

相对定量上下限（RQ min and RQ max）的计算

由于实验设置了重复，我们还需要对相对定量值添加上下限，定量PCR软件对上下限的计算给出了两种算法。默认的算法是置信区间算法（Confidence Level Algorithm），这种算法基于实验中Ct值的统计学分布进行的区间估计。另一种可供选择的方法是基于标准差的算法（Standard Deviation Algorithm），这种方法计算相对简单，只需要计算出ΔΔC_t的标准差值，是早期相对定量分析中提出的算法（KJ Livak,& TD Schmittgen, 2001）。我们分别来看这两种方法的计算上下限的过程。

首先来看置信区间算法，这里还是以刚才用到的比较C_t相对定量数据为例。该方法的细节推导详见文末的参考文献^[2]，这里只展示计算的过程。

首先我们需要分别对每个样本中的目的基因和内参基因的C_t值都计算标准差，计算公式如下：

对每个样本，利用计算得到的目的基因和内参基因的标准差，进一步计算ΔC_t的标准误差（ΔC_tSE），公式如下：

其中，n₁和n₂是每个样本中靶基因和内参基因的复孔数目。

计算过程还需要用到给定置信区间下的t值，在靶基因与内参基因的复孔数均大于2的情况下，可以通过下式计算自由度:

-ΔΔC_t置信水平为1-α的置信区间为

- ΔΔC_t±t_α/2(ν(ΔC_t))× ΔC_t SE

以常用的置信水平95%为例，对于本例中的样本，靶基因与内参基因的复孔数均为3，自由度即为ν(ΔC_t)=3+3-2=4，需要计算t_0.05/2(4)，可在Excel中由公式TINV(0.05, 4)给出，为2.776。依次计算上述各数值，最后得到RQ Min和RQ Max整理至下表：

 表4.置信区间法相对定量上下限结果计算  

在软件中，查看基于置信区间的上下限结果，可以看到，计算结果与上述计算一致。

图4.软件中置信区间法相对定量上下限结果计算

接下来是基于ΔΔC_t的标准差的上下限计算。上述计算中，我们已经完成了每个样本中内参基因与目的基因的标准差计算。对于每个样本，由于ΔC_t的计算需要同时用到目的基因和内参基因C_t值的均值，其标准差需要把内参基因和目的基因C_t的标准差同时考虑进来，这里以样本800为例，按下式计算：

计算ΔΔC_t值时，由于直接使用了对照样品的ΔC_t，认为其为一个固定数值，故认为对于单个实验样本，其ΔΔC_t的标准差与ΔC_t的标准差相等，如对样本800，有：

根据计算结果，对于每个样品，ΔΔC_t值正负一个标准差值作为其上下限。以样品800为例，ΔΔC_t,800为-0.766， 标准差为0.059，ΔΔC_t,800的上下限为-0.766±0.059，可得到上限RQ Max对应的ΔΔC_t值为-0.825，下限RQ Min对应的ΔΔC_t为-0.707。利用2^-ΔΔC_t算法，算得RQ Max为1.771，RQ Min为1.632。利用相似的计算过程，可以完成对样品400及样本1600中RQ Max和RQ Min的计算，计算结果如下表：

表5.基于标准差的相对定量上下限结果计算

若在软件中查看这种算法的上下限结果，我们可以查看Analysis->Analysis Settings->Relative Quantification Settings下的RQ Min/Max Calculations选项，并将默认的Confidence Level选项改为Standard Deviations，上下限默认一个标准差，勾选1，如下图所示：

图5.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software相对定量设置

回到Results界面下Relative Expression选项，查看软件给出的结果，上下限的计算结果与上述手动计算的结果一致。          

图6.软件中基于标准差的相对定量上下限结果计算