荧光定量常见问题分析（三）—QS3/5篇

2023-11-28 16:29:17, TAS团队赛默飞世尔科技生命科学产品

上期文章中我们介绍了qPCR实验中7500的常见问题和对应解决方案，本期，我们将着重分析QS3/5的相关案例：

两台QS5的仪器绝对定量结果显示不一样，比如标准品浓度为10⁵拷贝数的样本，其中一台显示结果是100,000.000（图1），另一台显示结果是100.000,000（图2），这是什么原因？

图1

图2

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为了满足不同地区计数方法的习惯，软件内置以上两种数据显示方法，可以通过软件界面的Tools->Preferences，在弹出的界面选择 Display Format->Decimal Point Format进行切换，之后选择保存即可（图3）。

图3

相对定量的实验，扩增曲线（Amplification Plot）正常（图1），但看不到基因表达的柱状图（图2），是哪里设置有问题吗？

图1

图2

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这个实验的设置其实没有问题，是因为有一个样本（L）的复孔结果差异太大（见图3的蓝色箭头），导致该样本误差线特别高（RQ MAX=653.646），所以其它RQ值在1左右的柱子都看不到了（图2）。选中该孔，右键单击后选择Omit，再重新分析就可以看得到柱状图了（图4）。

图3

图4

内参基因A没有扩增，目的基因E扩增正常（图1），查看A基因多组分图（Multicomponent Plot ）时，发现参比荧光ROX出现扩增（图2），是什么原因？

图1

图2

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核对实验方法时发现，A基因实际使用的是SYBR Green染料法，而不是探针法，查看Plate->Advanced Setup设置界面, 发现之前错误的将A基因的target信息设置成了ABY-MGB（图3），只需将A基因的target信息改成SYBR Green 之后，重新点击Analyze分析，即可看到A基因的正常的多组分图曲线（图4）和扩增曲线。

图3

图4

用QS5做多色探针法熔解曲线，除FAM外，其他通道的荧光（如：VIC/ROX/CY5等）都没有信号，这是什么原因？

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在QS3/5软件中选择Method->Action->Optical filter settings（图1），可以看到在默认设置下，熔解曲线只采集第一通道的荧光（图2红框处）。如果需要在熔解曲线步骤采集其它通道的荧光，应在设置反应时，在该窗口中同时勾选其它需要采集信号的通道（如采集VIC信号需要勾选图2绿框处x2m2），这样在实验结果中才会有其它荧光的熔解曲线信号。

图1

图2

在一实验中同时进行单重（TAMRA为报告基团）和多重检测（以FAM，VIC 和TAMRA作为报告基团），都是使用ROX作为参比荧光，样本是阳性质粒。实验结果发现，单重样本孔多组分图（Multicomponent Plot）中ROX 在有的样本孔中正常，有的样本孔中抬升，有的样本孔中下降（图1）。多重样本孔中ROX信号虽然是正常的，但是FAM和VIC阳性质粒都没有扩增（图2）。这是什么原因？

图1

图2

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通过Raw Data 分析发现，数据中标注TAMRA 为报告基团的单重样本孔，在第一和第二通道都有荧光信号（图3）；相反，标注多重的样本孔，在第一和第二通道信号却为零（图4）。由此推断该现象很可能是单重样本孔和多重样本孔的Target 设置颠倒导致的，也有可能是将PCR板翻转了180°放入仪器中。重新设置Target后，分析发现所有样本孔ROX信号正常，各目标基因扩增结果也和预期相符。

图3

图4

分析后没有出现完整的扩增曲线（Amplification Plot），扩增曲线显示有10个循环（图1），但多组分图（Multicomponent Plot ）有完整的扩增信号（图2），是什么原因？

图1

图2

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本数据的Run method 中有两个PCR Stage, 第一个PCR Stage是10个循环, 第二个PCR Stage是40个循环（图3），分析设置中数据点显示选择了第一个PCR Stage，所以扩增曲线只有10 个循环, 只要从Analysis Settings->CT Settings->Data Step Selection选项更改成第二个PCR Stage（图4）, 就可以正常显示完整的扩增曲线。后期实验也可以不采集第一个PCR Stage 的荧光信号，只采集后面40 Cycle 的信号。