荧光定量常见问题分析（四）—StepOnePlus篇

2024-01-11 16:15:25, TAS团队赛默飞世尔科技生命科学产品

上期文章中我们介绍了qPCR实验中QS3/5的常见问题和对应解决方案，本期，我们将着重分析StepOnePlus的相关案例：

查看实验结果时发现熔解曲线（Melt Curve）是异常的（图1），但同一个数据在另外一台电脑上打开时，熔解曲线却又是正常的（图2），这是什么原因？

图1

图2

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查看多组分图（Multicomponent Plot）发现体系中ROX浓度太低（图3），在QC Summary中也报了BADROX的错误。对于这个实验，图1是在熔解曲线选择了使用Enable Passive Reference Normalization（图4红框处），导致熔解曲线不正常，在分析设置（Analysis Settings->Melt Curve Settings）中取消这项再重新分析即可。另外，建议提高体系中ROX浓度以避免以后继续出现这种问题。

图3

图4

StepOnePlus采用SYBR Green染料法进行定量实验，实验结束之后扩增曲线（Amplification Plot）正常（图1），但是熔解曲线异常（图2），这是什么原因？

图1

图2

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查看原始数据，在多组分图（Multicomponent Plot）中发现扩增循环阶段的荧光信号呈现锯齿状抬升（图3），说明在多个阶段收集了荧光信号。查看Run method设置，发现每个步骤都采集了荧光信号（图4），导致多组分图扩增信号呈现锯齿状以及熔解曲线信号异常。通常针对SYBR Green染料法实验只需在扩增阶段的退火/延伸步骤以及熔解曲线升温步骤采集荧光即可。

图3

图4

实验结束后，发现有些孔扩增曲线（Amplification Plot）异常（图1），QC Summary中很多孔报BADROX（图2），这是什么原因造成的？

图1

图2

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查看多组分图（Multicomponent Plot），发现SYBR荧光上升时ROX荧光异常下降导致了BADROX的报错和扩增曲线异常。这个问题是由于SYBR的信号太强导致的（可能与试剂中SYBR染料浓度过高有关），建议使用我们的PowerUp SYBR Green 预混液。另外，还可以尝试通过降低引物浓度来降低SYBR的荧光信号，减小其对ROX荧光的影响。

图3

相同的引物试剂做的实验，两次数据ΔRn差异很大，一次是几十万数值（图1），另一次只有个位数数值（图2），是什么原因？

图1

图2

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第一个数据设置时，Passive Reference 选了None（图3）,第二个数据设置时选择了ROX（图4）, 这是设置不同导致的分析差异。如果选择了ROX，ΔRn的计算值会采用ROX做均一化，从而数值较小。建议根据试剂中是否包含参比荧光ROX来选择设置方法。

图3

图4

荧光定量结果有2个样本的Ct值异常，如图所示，E3、F3两孔 Ct值分别为14.24和13.31，但是扩增曲线（Amplification plot）都在22个循环以后出现抬升（图1），这是什么原因？

图1

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查看多组分图（Multicomponent plot ），如图2所示：E3、F3的基线期荧光信号有轻微上升，可能是因为探针和引物相互作用或者模板质量问题等因素，导致软件自动判断基线期错误。需要手动调整基线设置，按如下步骤设置：Analysis->CT Settings ->取消勾选Use Default Settings，Automatic Threshold，Automatic Baseline->手动调整End cycle->点击Apply Analysis Settings（图3），重新分析后Ct值正常（图4）。