荧光定量常见问题分析（二）—7500篇

分析发现A9 孔显示红色方框（图3），并且多组分图（Multicomponent Plot）中显示该孔荧光信号为零（图3左下角）。经核实该孔没有加样，但仍被设置了Target和Sample，去掉该孔的设置后重新分析，导出结果时可以正常勾选Results（图4）。

这是因为程序设置方式不对导致的。本实验的熔解曲线步骤是手动逐步添加的，虽然升降温步骤是正确的（图3），但是这样添加的熔解曲线步骤是不收集荧光的。因此7500 V1.x软件添加熔解曲线步骤时，必须要使用Add Dissociation Stage按钮进行添加（图4）。

查看Raw Data发现第5通道（CY5）没有扩增而第4通道（ROX）都有扩增（图2），经核实后发现实验用的应该是ROX标记内标的试剂盒，但误记成了CY5标记内标。只需要在Plate Setup中将内标Target的Reporter改成ROX，再重新分析就可以了（图3）。

查看实验的多组分图（Multicomponent Plot），这些没有Ct值的孔基线期的荧光信号都很低，基本上在0以下（图3）。因此软件不能正确设定基线的起始和终止位置，导致没有Ct值。在本次实验中，使用了错误的反应托架， 7500 qPCR仪器扩增时放置8联管和96孔板的托架是不一样的（图4），请勿混用。

查看实验设置发现四重qPCR实验中所使用探针的报告基团分别为FAM，VIC，CY5和TEXAS RED（图3），此外预混液中含有参比荧光ROX（图4）。由于TEXAS RED和ROX同属于第四检测通道，一次实验中同时使用两个相同检测通道的染料进行实验会导致结果异常。建议使用不含ROX为参比荧光的预混液，或者更换探针荧光标记。

这个报错的原因是热盖没有闭合好，可能的原因和解决方法如下：

（1）耗材（8联管或者96孔板）不匹配或者没有正确放置。可以尝试不放耗材运行实验，如果不报错，则说明是耗材问题。建议在仪器上使用配套的耗材和Plate Holder。如果使用8联管，请竖着对称放置，并在第1列和第12列放置空的8联管进行平衡（图1）。

（2）热盖门没有拉好，常见于打开过仪器面板进行操作（例如清理Block）之后。关闭仪器及电源，将仪器上半部面板打开，确认中间黑色面板是否在最靠近人的一侧，如果不是，可以手动将其拉出复位（图2）。

如果以上方法都不能解决，请联系硬件工程师。