荧光定量常见问题分析（五）—qPCR试剂篇

Context Sequence 是一段包含探针序列的25 bp序列信息，在订购以后可以通过AIF文件查看，AIF文件下载链接如下：https://www.thermofisher.com/order/taqman-files。

普通的Assay（FAM或VIC标记探针），反应体系中引物终浓度是 900 nM ，探针终浓度是 250 nM；用于多重实验的VIC-PL Assay（VIC标记探针，限制引物浓度），反应体系中引物终浓度是150 nM，探针终浓度是 250 nM。

反应体系中引物终浓度是 900 nM ，探针终浓度是 200 nM。

在官网的Assay产品页面（如下图），View Details选项查看Context Sequence， 序列是按标记 [VIC/FAM] 染料顺序显示碱基的。

使用茎环法检测MicroRNA时，待测样本中外参的终浓度是5-10 pM，外参模板5’末端不需要磷酸化；使用加尾法检测MicroRNA时，待测样本中外参的终浓度是1-10 pM，外参模板5’末端需要磷酸化。外参RNA可以在RNA抽提前或者反转录时加入样品中，用来质控RNA抽提效率或反转录效率。

TaqMan MicroRNA Assay以miRBase数据库中收录的成熟体MicroRNAs序列为模板设计相应的反转录茎环引物和qPCR引物探针，其命名与Assay设计时所参考版本的miRBase数据库中该成熟体序列注释名称相对应，如图中hsa-miR-674。而新版本miRBase数据库移除了该成熟体序列在人中的注释信息，因而出现了该情况。因此为避免检索TaqMan MicroRNA Assay时出现错误，推荐用MicroRNAs成熟体序列检索。

茎环法检测MicroRNAs时需要准备反转录试剂盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit （货号为：4366596），TaqMan MicroRNA Assay（货号为：4427975），以及qPCR预混液TaqMan Universal Master Mix II, no UNG （货号为：4440040）或TaqMan Fast Advanced Master Mix （货号为：4444556）。简要中文操作说明书见链接：https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets/BID/Reference-Materials/TaqMan_MicroRNA_Assays_quick_manual_zh.pdf。

加尾法检测MicroRNAs时需要准备反转录试剂盒TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （货号为：A28007），TaqMan Advanced miRNA Assay （货号为：A25576），以及qPCR预混液TaqMan Fast Advanced Master Mix （货号为：4444556）。简要中文操作说明书见链接：https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0019132_TaqManAdv_miRNA_Assays_QR_ZH-CN.pdf。

NFQ-MGB为淬灭基团时，MGB（Minor Groove Binder）作为小沟结合物可以提高探针的Tm值。在探针序列保持不变的基础上，如果直接将淬灭基团由NFQ-MGB换为TAMRA会导致探针的Tm值过低，可能会影响探针与模板的结合效率。查看探针序列发现当淬灭基团为NFQ-MGB时探针的Tm值为68 ℃，更换为TAMRA时Tm值仅为45.4 ℃（图2），而qPCR运行程序中退火延伸步骤的温度为60 ℃（图3），所以新合成的探针无法与模板结合，导致没有扩增信号。如果需要把MGB探针改为非MGB探针，建议重新设计探针序列。