技术前沿 | 最新深度报道！癌症空间代谢组学策略，“鉴往知来”找准癌症研究新方向~

Part.1

目前癌症研究中的MS方法

作者在第一部分总结了现在癌症研究中应用的质谱技术。基于质谱技术的各种组学为全面深入了解癌症发展、指导药物开发和治疗方法提供了坚实的分子基础。对于非成像质谱技术而言，也就是常规的质谱技术，比如气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography‐MS，GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography‐MS，LC-MS）以及毛细管电泳-质谱联用技术（capillary electrophoresis‐MS，CE-MS），都已经在多种癌症的分子标志物研究等方面中发挥重要作用。但是它们都有一个共同的缺点，即不能提供分子的空间分布信息。因此质谱成像技术应运而生。

MSI作为一种广谱的，无标签的成像方法，可以对各种生物分子进行空间可视化，比如蛋白质、多肽、脂类、多糖、氨基酸以及寡核苷酸等。因此，MSI技术被广泛地应用于众多生物和临床研究，并促进了不同类型癌症的空间代谢组学和蛋白质组学研究发展。

Part.2

MS的基本原则

第二部分开始简介空间代谢组学技术的应用，以及样本制备、数据处理等方面的注意事项。

空间代谢组学涉及对组织、器官和细胞中的代谢物（主要是分子量小于2000 Da的分子，如脂类、氨基酸和糖类）的空间分布和改变的研究。这类研究有助于可视化和准确定位这些生物大分子的位置，为了解感兴趣的生物过程（如疾病进展机制）提供了一个额外的维度。一般来说，从空间代谢组学实验中获得的信息与存在于某些组织区域或微区、器官和细胞中的生物分子功能紧密相关。其他空间技术观察到的组织变化或异常子结构的出现（如组织的异质性），可以与这些化合物分子水平的改变联系起来。在癌症研究中，生物大分子丰度的空间信息和改变反映了癌症的发展。空间分辨率的信息也可以与其他研究相关联，如通过GC-，LC- ，CE-MS和NMR测量的生物液体中的蛋白质、肽、代谢物和脂质丰度的时间分辨率。因此，MSI在癌症研究中得到了普及（图1）。

图1 | 自2010年起，谷歌学术中关于“mass spectrometry imaging”和“cancer”的发文量

进行空间代谢组学研究有如下几项注意点：

首先是样品制备。MSI实验工作流程的第一步是获得高质量的组织切片，因为这些切片的状况和均匀性程度在很大程度上决定了MSI数据的质量和可重复性。有许多因素会影响MSI数据的质量，比如样本的生物特征、采集时间等。而样本制备也是MSI研究中差异的主要来源。一般来说，采集组织后直接在液氮中速冻可能会由于冷冻时间不均一导致组织开裂或者破碎。因此，在冷冻前，组织可以被嵌入羧甲基纤维素和明胶水溶液中，然后再被冷冻，这样样本可以在-80°C储存至少一年。在样本切片时，也要使用冷冻切片机进行，且应避免组织的折叠、破裂和移位。

其次是质量轴校准。这是MSI工作流程中进行可靠化合物鉴定的关键步骤。即使像FTICR这样的高分辨率质谱仪可以提供最精确的质量测量（平均可以达到<1 ppm的质量误差），仍然需要适当的校准技术，以确保在数据收集期间有最小的质量轴变化。

然后是批次效应。在MSI实验中，批次效应可能来自于组织采集、储存、切片及数据收集。实验室环境、仪器条件和操作的变化也是批次效应的来源。批次效应存在于像素与像素之间，切片与切片之间，以及样本与样本之间。通常情况下，批次效应会给一些变量带来偏差，如峰值丰度，这导致不同样品之间真正的生物差异被掩盖。目前仍在努力尝试解决MSI批次效应，包括设计更稳健的工作流程，选择质量控制样本，以及开发更好的归一化方法。

再次是可视化。在MSI实验之后，特征（Features）可以被可视化为热图，逐个像素地显示代谢物在组织中的分布和丰度。通过图像反映整个组织中的实际分子分布是至关重要的。目前已经有很多商业（如SCiLS Lab）和开源程序（如BioMap、MSiReader、Cardinal）应用于此。

接下来是特征注释和鉴定方面。为了进行代谢途径分析，必须对MSI质谱特征进行正确注释。在癌症研究中，代谢途径分析会反映了癌症的发病机制，而不正确的注释会产生假阳性结果，这一点至关重要。从MSI实验中产生的完整质谱中，可以获得有限的结构信息。因此，通过将测量的m/z值与数据库进行比较，只可能进行假定的特征注释。因此，在这一层次的分析中，准确的分子量测定是至关重要的。后续在进一步实验中，串联质谱（MS/MS）的使用可以为特征注释和鉴定提供更好的帮助。

最后是数据分析方面。在数据处理步骤之后，通过采用如归一化、数据压缩（例如，使用分层聚类的空间分割）和缩放等处理，对MSI数据进行统计分析。通过数据分析特定代谢物或脂质的丰度变化，然后可以与癌症进展相关联，可以为癌症研究提供帮助。例如，一些脂质的改变可以反映细胞增殖、分化和凋亡。基于改变的代谢物特征的适当统计模型也可以成为癌症诊断的有力工具。常用的统计分析方法包括单变量分析（T-test、方差分析等）、多元统计分析（如主成分分析（principal- component analysis，PCA），偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），t-SNE（t‐distributed stochastic neighbor embedding）和UMAP（uniform manifold approximation and projection）等）、以及ROC（receiver operator characteristic）分析等。

Part.3

MSI在癌症研究中的应用

这一部分，作者讨论了2017年以来MSI在空间癌症代谢组学中的应用。MSI技术在临床上的实施也在迅速增加，机器学习的普及使MSI成为一个强大的癌症诊断工具。利用三维MSI重建三维组织可以更全面地了解癌症在高度异质性组织上的扩散。此外，单细胞水平的MSI可以提供癌症发展的细节，而不需要对整个群体进行平均化。

首先是脂质相关的研究。脂质是一类密切参与癌症发病机制的化合物。据估计，有超过100万个分子种类是脂类。它们的疏水烷基尾巴（或侧链）的变化如链长，为脂类增加了各种生化特性。例如，研究表明，磷脂酰肌醇磷酸酯（phosphatidylinositol phosphate，PIP）的侧链在p53突变的癌细胞中会发生改变。脂质分子的两面性使得它们作为重要分子，在促进细胞生长、增殖和分裂方面发挥着重要作用。例如，癌细胞可以消耗、生产和转化各种类型的脂质，以支持癌细胞的生长，并为肿瘤转移提供能量。同时，身体对癌症的免疫反应也会改变特定的脂质途径。因此，癌症发展过程中脂质丰度的改变被视为疾病对器官及其环境直接影响的结果，同时也是身体对介导癌细胞死亡的相应反应。因此，针对脂质进行分析研究，可以为更深入了解癌症发展机制提供帮助。

此外，众多研究表明，脂质可以作为早期癌症的生物标志物，也可以被用于手术决策。但脂质分子的复杂组合性和多样性导致了对其检测和定量的困难，特别是在复杂的生物系统中。MSI可以直接看到癌症组织中的脂质分布和丰度变化。通常，癌症脂质组学研究的MSI工作流程包括样品收集和预处理、质谱特征的获取和可视化、特征注释和数据处理，包括（但不限于）脂质途径分析、分类统计模型的开发和生物标志物分析（图2）。目前，MSI已被广泛用于了解乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和胃癌等癌症发病和发展机制。比如在对乳腺癌的研究中显示，几个重要的脂肪酸和甘油磷脂被确定为介导这些不同亚型的细胞信号传导和凋亡的关键分子，为了解乳腺癌的进展情况提供了线索。此外，MSI实验也可以与已有的临床工具和程序相结合，对癌症的发展和诊断进行更详细的评估。例如一项关于前列腺癌的研究中，MSI结果与临床数据如组织学分级相结合，用于前列腺癌的诊断。

图2 | 一个典型的利用MSI脂质组学研究癌症的流程

除脂质外，糖类是细胞中另一类重要分子，参与了许多涉及癌症进展的生理病理过程，包括细胞粘附、细胞间相互作用、信号传导、炎症、肿瘤细胞侵袭和转移。具体来说，上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是上皮细胞开始失去极性并获得迁移性和侵袭性，最终导致肿瘤转移的主要过程。糖类水平的改变已被证明与此类过程密切相关。在最近一项关于人类透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）组织的研究中，发现带有双节N-乙酰葡糖胺（N‐glycans with bisecting N‐acetylglucosamine，GlcNAc）和多个岩藻糖基化残基的N-糖与ccRCC的发展有关，并且主要分布在肾脏的近端小管区域。此外，对整个肾脏组织，包括皮质、髓质、肾小球和近端肾小管中N-聚糖的全面绘制表明，有几个ccRCC的特异性特征可用于划分肿瘤。

三维组织结构的重建对于更好地理解代谢物的空间分布、整个组织中代谢物的生化相互作用、信号传导途径和癌症的发展非常重要。一般来说，在三维MSI实验中，二维图像从一系列相邻的组织切片中获得，然后将二维图像“对齐”并合并成三维图像数据集。因此，改进三维模型重建的策略在MSI研究中至关重要。三维图像匹配最直接的方法是将靶标嵌入到组织切片上作为参考点。光学或MS图像的解剖学特征也被用来对齐二维MS图像。然而，对齐工作大多是手动进行的，只有具有明确和可见结构的组织才能准确对准。多变量技术，如t-SNE，也被用来简化二维图像维度的复杂性，将组织切片分割成光谱相似的区域。

目前，二维图像间的对齐仍然具有挑战性。三维模型中组织亚区的分配是三维MSI实验的另一个主要挑战，三维MSI数据分析的工作量仍然比较大。尽管有这些挑战，3D MSI已被越来越多地应用于癌症研究。例如，一项研究中，通过对齐49个小鼠脑组织切片，构建了一个3D大脑模型，以可视化转移髓母细胞瘤的脂质标记（图3A），并讨论了几种脂质的分布及其在癌症转移中的作用，为诊断和治疗提供了见解。在另一项研究中，从162个连续的人类口腔鳞状细胞癌组织中重建了一个三维模型，将二维MS图像与苏木精和伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色图像和免疫组化图像进行核对，构建了三维模型（图3B）。

图3 | 3D质谱成像的构建

其他成像方式与MSI的结合分析可以最大限度地获得化学和生物信息。许多成像方式（包括显微镜、转录组学、光谱学等）已经成功地与MSI技术相结合，这些多模态成像技术已被广泛用于癌症研究。图4显示了多模态成像工作流程的几个例子。显微镜工具大多与MSI一起被用于癌症研究。例如，H&E染色已被广泛用于癌症病理学，并与各种MSI技术相结合。H&E染色的显微图像可以帮助观察组织的形态，染色后看到的特定组织学特征可以帮助识别和区分组织中的肿瘤区域。免疫荧光（Immunofluorescence，IF）显微镜也可以与MSI结合。在治疗胰腺导管腺癌的研究中，吉西他滨及其代谢物首先通过MSI进行了可视化。在相同的组织上进行IF分析，并与MSI图像核对，以评估药物诱导的肿瘤DNA损伤。

图4 | 癌症研究中，质谱成像技术与其他成像技术如H&E的整合示例

近5年来，MSI在临床研究中得到了越来越多的应用，它提供了独特的细胞类型特异性分子图谱，直接显示了肿瘤的异质性，并有广阔的化合物覆盖面，使其成为目前临床诊断工具的宝贵补充。研究发现，利用MSI发现的诊断性分子特征可以很准确的识别肿瘤区域并将其与邻近的健康区域区分开来。与组织学染色技术和多变量统计工具一起，MSI已被经常用于准确的肿瘤边缘评估。比如MSI可以作为评估和定义胰腺癌手术切除边缘的工具。另一项研究表明，MSI能够在3分钟内帮助估计和确定胶质瘤的切除边缘，灵敏度为93%，特异性为83%。

MSI在药代动力学研究中的应用，可以通过可视化抗癌药物在目标组织中的空间分布，实现对抗癌药物疗效和效率的评估。因此，MSI已被用于指导抗癌药物设计，监测和优化癌症治疗方法。目前也有研究采用MSI技术对药物的药代动力学耐药性进行考察，即药物是否能以足够高的浓度输送到肿瘤中，以及这种药物的空间分布。例如，一项研究利用MSI绘制了一种抗血管生成药物舒尼替尼（sunitinib）在兔肝脏肿瘤组织中的分布图，并展示了几种不同肿瘤区域的异质性药物分布。

近年来，需要更有效的数据处理工具来适应MSI的快速发展，因为现在每次实验都会产生非常大的多维数据集，特别是在高（质量和空间）分辨率条件下。从数据集中提取重要的生物化学信息是一个真正的挑战。建立强大的机器学习模型是非常有意义的，它可以用来预测癌症亚型，建立癌症进展模型，发现癌症生物标志物，并在早期阶段诊断癌症。因此，机器学习和深度学习已被广泛地应用于MSI研究，以解释MSI数据并建立适当的预测模型来分析新的临床数据集。一些机器学习和深度学习算法已经被开发出来，以提供更有效的MSI数据分析方法和癌症生物学问题的答案。例如，从人类前列腺癌组织切片中收集的高度稀疏的MSI数据集被压缩，并使用基于变异自动编码器神经网络（variational autoencoder neural network）的深度学习算法进行聚类。这个网络被训练来学习和捕捉用于预测原始数据集的光谱特征，可以在降低数据维度的同时避免光谱特征损失。然后，降维的数据集被用于通过肿瘤相关特征的聚类分析来识别前列腺肿瘤区域。该算法在小鼠胶质母细胞瘤组织切片的三维MSI数据集上进行了进一步测试，同样表现出高效的数据压缩和高质量的光谱预测。

尽管MSI已经成为空间代谢组研究中最有前途的技术之一，并已经开始了应用。但为仍有一系列提高分析性能的挑战，比如可重复性低、采集时间长、代谢物注释难等。这些问题都在被研究者努力的解决。此外，如机器学习等方法的发展，也会对MSI研究提供帮助。因此，基于MSI的癌症中的应用研究将继续增长。

这篇综述较为全面地介绍了MSI技术及其在肿瘤研究中的应用。基于MSI的空间代谢组学由于可以提供独特的代谢物空间信息，在区分肿瘤与癌旁，肿瘤异质性等研究中被广泛应用，可以为肿瘤发展、诊疗机制提供更为深入的代谢物-位置-功能方面的理解。

鹿明生物的AFADESI-MSI空间代谢组技术，受到AFADESI-MSI原创团队核心专家-贺玖明教授全力支持。可检测空间分辨率包括100um*100um、40um*40um等多种空间分辨率。自2021年1月1日起，已落地执行100+项目，已建立多种脑、心、肝等多种组学的空间代谢组自建数据库。AFADESI-MSI平台不涉及基质喷涂，定性到的物质中30%为脂质，70%为700Da或者500Da以下的小分子物质，可更均衡地涵盖1000Da以下的小分子物质。

鹿明生物也是国内最早开始同时进行空间转录组与空间代谢组的公司。基于AFADESI平台发表的方法学及应用文章目前已在Gut、PNAS、Theranostics、Advanced Science、Analytical chemistry、Analytica Chimica Acta等期刊上发表相关文章10+篇。

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