项目文章 | 接踵而来，江苏南通大学神经再生重点实验室顾晓松课题组微环境研究再发新成果

2021年11月欧易/鹿明生物合作客户江苏省南通大学神经再生重点实验室顾晓松院士团队，顾芸教授在Biomaterials期刊发表了题为“BMSC-derived extracellular matrix better optimizes the microenvironment to support nerve regeneration”的研究成果，通过TMT标记蛋白组+免疫荧光研究方法，发现骨髓干细胞来源的细胞外基质能优化神经细胞再生微环境，为周围神经缺损临床修复提供了新的替代方案。

外伤性周围神经损伤是一种常见的临床难题，目前的治疗方法难度大、疗效低。鉴于自体神经移植供体病变的高风险，以及供体组织的来源有限，创造一种有前途的组织工程神经移植修复缺损神经将是未来临床治疗神经损伤的重要方向。

细胞外基质(ECM)是一种复杂的、由可溶性和不可溶性分子组成的异质网络，为细胞和组织的生长与修复提供了天然微环境的物理结构和生化环境，越来越多的证据表明，ECM有助于指导细胞行为和组织再生。基于这一认识，ECM神经移植，如自然衍生的脱细胞组织(也称为组织衍生的ECM支架)，用单个ECM组件修饰的支架，以及培养的细胞衍生的ECM修饰的组织工程材料已经被成功构建。

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1.TMT标记蛋白组学分析细胞源的胞外基质和脱细胞神经的蛋白质组

图1 | 细胞来源的ecm和脱细胞神经的定量蛋白质组学研究

a1：通过质谱鉴定的2302个蛋白的Venn；

a2：PCA图显示15个样本之间无监督聚类；

a3：所有样品蛋白质的热图。显著富集了下调(绿色)和上调(红色)的细胞生物过程(p<0.05)。比例尺显示表达水平(红色表示上调，绿色表示下调)；

b1：维恩图比较不同组的137个基质蛋白成分，直方图显示了特有或共有的蛋白数量。Uniq1分别表示SC-ECM、BMSC-ECM、SKP-SC-ECM或成纤维细胞- ecm中的特异性蛋白。Uniq2是指脱细胞神经中的特定蛋白质。Common指细胞衍生的ECM和脱细胞神经共有的蛋白；

b2：5种ECM中基质蛋白含量。

利用TMT标记蛋白组学分析比较施万细胞（SCs）、成纤维细胞（FBs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）、皮肤祖细胞分化的施万细胞（SKP-SCs）的ECM和脱细胞神经的蛋白质成分，发现五种细胞外基质之间有76个共有蛋白质(图1A-a1)。通过聚类分析发现骨髓间充质干细胞（BMSC-ECM）与一部分脱细胞神经重叠，表明BMSC-ECM和脱细胞神经之间有相似的蛋白质组学图谱(图1A-a2)。研究者通过进一步的生物信息学分析和MatriSomeDB过滤来比较和分析五种细胞外基质的基质蛋白类型和含量的差异，发现BMSC-ECM与脱细胞神经最为相似，因此最终确定BMSC可以作为细胞外基质生成的优良亲本细胞。

2.细胞源性细胞外基质和脱细胞神经的结构和特征

免疫染色、共聚焦成像及3D结构重建分析并构建了来自SCs、FB、BMSCs、SKP-SCs和脱细胞神经的ECM的3D空间结构（图2）。此外，利用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分析揭示细胞衍生的ECM和脱细胞神经的微结构(纳米纤维的结构)。

结合蛋白质组学数据和细胞来源的ECM和脱细胞神经的结构特征，研究人员认为BMSC-ECM可能更接近于模仿天然神经ECM的组织特异性生化和结构属性。

图2 | 免疫染色3D、扫描电镜图和投射电镜图 

A. ECMs结构与特点ecm的纤维连接蛋白(白色)、层粘连蛋白(红色)、I型胶原蛋白(金色)、IV型胶原蛋白(绿色)免疫染色3D图像，用Imaris软件分析，比例尺5μm。

B.扫描电镜图(b1)和透射电镜图(b2)显示细胞来源的ecm和脱细胞神经的超微结构。比例尺，(b1)为5μm， (b2)为1μmb2

3.背根神经节(DRG)体外培养模型评估物种ECMs支持神经突生长的能力

DRGs分别在来源于施万细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤祖细胞分化的施万细胞的细胞外基质上培养，以聚赖氨酸包被的载玻片上培养为对照。48小时后， NF200免疫荧光染色测定DRG神经元的生长，并用层粘连蛋白标记细胞外基质。在ECM上培养的从DRGs延伸的神经突起比在涂有PLL的载玻片上培养的从DRGs延伸的神经突起更长且更分叉，表明ECM显著增强了DRGs的轴突生长(图3a和图3b)。

此外，在骨髓间充质干细胞-细胞外基质上培养的DRG神经突起的突起长度和覆盖面积大于在其他细胞外基质上培养的(图3c)。这一结果进一步证明，骨髓间充质干细胞可能是生成更适于神经再生微环境的细胞外基质亲代细胞。

图3 | ECM上DRG神经元的轴突生长

A. 双免疫荧光显微图显示DRGs的轴突生长(NF-200，绿色)，培养于SC、BMSC、SKP-SC和成纤维细胞衍生的ECM(层粘连蛋白，红色)上，对照为PLL，比例尺为500μm；

B. 使用相对定量方法测量NF阳性神经突起延伸的最大距离和分支数量。比例尺1000μm；

C. 从染色观察得到的直方图，显示从DRGs延伸的轴突长度和面积的定量比较(n = 5)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001与pll涂层;# # # p < 0.01, p < 0.05, # # # p < 0.001和SC-ECM;Δp < 0.05,ΔΔp < 0.01,ΔΔΔp < 0.001和BMSC-ECM。

4.神经移植物制备

为了证明细胞外基质支持体内神经再生，开发了基于壳聚糖/丝素蛋白的细胞外基质修饰的神经移植物，如示意图所示(图4a)。基于蛋白质定量，将施万细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤祖细胞分化的施万细胞按比例培养在壳聚糖导管/丝素蛋白基神经支架上，并用维生素C刺激14天。接下来，用扫描电镜研究去细胞前后细胞在丝素蛋白纤维和壳聚糖导管上的粘附和生长。我们注意到细胞螺旋缠绕，包裹SF纤维形成并排或端对端的多层细胞链；然而，它们的生长在壳聚糖导管的外表面和内壁上显示出不规则的排列。脱细胞后，细胞外基质的形态学特征显示了包裹SF纤维的多层网状结构，或者在壳聚糖导管的外壁和内壁上的松散组织的纱布网(图4b)。

图4  | ECM-NGs的制备以及特性

5.细胞外基质修饰的神经移植物的体内植入及其评价

5.1神经功能评估

为了研究细胞外基质修饰的神经移植物修复周围神经缺损的能力，将细胞外基质修饰的神经移植物和对照支架植入大鼠坐骨神经缺损(10 mm)中。从术后4周开始，进行行为学测试，观察各组大鼠和对照组大鼠感觉和运动功能的恢复情况(图5A a1)。BMSC-ECM-NG组的足迹、接触强度和坐骨神经功能指数(SFI)比其他组恢复更好(图5a2-4)。经过感觉功能测试发现BMSC-ECM-NG组表现出比其他组更好的机械异常性疼痛和热痛觉过敏的恢复，其水平接近基线(正常)，在NG移植后12周没有显著差异(p = 0.81 )(图5a5-6)。

图5 |  ECM-NG移植后神经功能的评价

5.2移植后轴突再生观测结果展示

为了进一步验证细胞外基质修饰的神经移植物在神经再生中的作用，用NF200和S100β进行了免疫组织化学检测神经再生。结果显示，两组再生轴突均随壳聚糖导管内SF填充物从近端残端向远端残端延伸，术后2周BMSC-ECM-NG组和SC-ECM-NG组的神经纤维长度明显大于其他三组(图6a)。

图6 | 细胞外基质-神经生长因子移植后轴突再生

5.3移植后轴突髓鞘再生观测结果展示

再生神经的透射电镜检查显示，髓鞘再形成的神经纤维呈簇状分散，结构致密均匀，由清晰的电子致密髓鞘组成。此外，BMSC-ECM和SC-ECM修饰的神经移植物2组的再生神经的髓鞘厚度、髓鞘层数和平均轴突直径均高于其他细胞外基质修饰的神经移植物组 (图7)。

图7 | 细胞外基质-神经生长因子移植后轴突髓鞘再生

5.4.靶肌肉的修复效果评估

坐骨神经损伤通常会导致其目标肌肉萎缩。靶肌肉的神经再支配是衡量周围神经修复效果的重要指标。用α-银环蛇毒素和NF200免疫染色观察和评估胫前肌的运动终板的形成。在所有组中，受伤侧的运动终板与对侧未受伤(正常)侧的运动终板相比相对较小且不成熟。BMSC-ECM修饰的神经移植物组中成熟的或重新神经支配的终板比在其他细胞外基质修饰的神经移植物组中丰富得多。然而，SC-ECM修饰的神经移植物和BMSC-ECM修饰的神经移植物之间没有观察到可检测的差异(p = 0.33)。此外，由于再生轴突的重新神经支配，术后12周，用BMSC-ECM-NGs和SC-ECM-NGs治疗的大鼠的靶肌肉的湿重始终显著高于其他大鼠(图8)。

图8 | 胚胎干细胞移植后靶肌肉的再支配和湿重

综上所述，这些结果证实BMSC-ECM-NG比其他ECM-NG组更好地介导轴突运输和传导的显著恢复，同时增强神经再生和进一步的髓鞘再形成。

6.TMT标记定量蛋白组-细胞外基质修饰的神经移植物形成的再生微环境分析

对植入10mm坐骨神经缺损的自体移植物(对照组)和细胞外基质BMSC-ECM修饰的神经移植物2周后的再生神经利用TMT蛋白组学检测其蛋白表达谱。研究发现BMSC-ECM-NG无论在总的DEPs还是与神经生长、炎症和免疫反应相关的DEPs上，与自体神经之间的DEP数和表达差异最小。

图9 | 细胞外基质-神经生长因子形成的再生微环境分析。

综上所有结果表明，所有的细胞外基质修饰的神经移植物均有助于神经再生，而骨髓间充质干细胞修饰的神经移植物通过提供更有利的再生微环境获得了更好的修复效果，即骨髓间充质干细胞修饰的神经移植物诱导了神经再生相关因子的高表达，并表现出与自体神经非常相似的低免疫原性。

鹿明生物具有丰富的蛋白组学项目经验，可以为您提供高质量蛋白组学技术服务。

TMT标记定量蛋白组技术是近些年比较热门的蛋白组学定量技术，主要具有一下优势：

1、通量高：可一次性分析6、10、16、18个样品

2、重复性好：所有样品的分离鉴定条件一致

3、定量准确：减少了样本处理、以及不同组上机造成的实验误差，因此能达到定量更准确的效果

4、灵敏度高：可检测到表达丰度为皮克（pg)级的蛋白。

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灵犀|撰文

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