直播回放｜袁必锋教授课程回顾

因为灵敏度比较高，我们考虑能否实现单细胞中的检测核酸修饰（之前这个是没有报道的）。我们发现确实可以检测到单细胞的DNA修饰和RNA修饰。能够实现单细胞检测，我们首先想到循环肿瘤细胞，一毫升血里面只有几个循环肿瘤细胞，目前循环肿瘤细胞的核酸修饰还没人做过。首先把血里的循环肿瘤细胞富集出来，用我们高灵敏的分析方法检测分析，确实发现了循环肿瘤细胞DNA甲基化修饰和RNA甲基化修饰的含量是有所变化的，循环肿瘤细胞和全血细胞是有不一样的。

刚才主要讲的是DNA胞嘧啶修饰，现在讲一下DNA的腺嘧啶修饰。为什么做这个呢，因为哺乳动物细胞的DNA修饰主要是m5dC，hm5dC，f5dC和ca5dC。那有没有新的修饰？我们把目光聚焦到腺嘌呤甲基化修饰。

因为这个是在细菌发现的，丰度很高，但是哺乳动物中没有发现，一个难点是组织或细胞有或多或少细菌的污染，造成假阳性结果。怎么解决呢？我们设计了一个方式，用Dpn1酶解，它微生物丰度较高，可以将微生物的DNA酶解成小片段，而哺乳动物丰度低，就可以保留比较大的片段，再通过超滤的方式，只保留大片段的哺乳动物DNA片段，之后就可以用质谱检测了。

我们确实在哺乳动物中检测到甲基化修饰的腺嘌呤，含量不是很高，大概百万分之几。2018年有研究在人的基因组里面做DNA腺嘌呤甲基化修饰的工作，主要是定位的工作。上个月有文章，探索了哺乳动物细胞中DNA腺嘌呤甲基化的来源，认为它来自RNA m6A降解。

扩展了list之后，我们还想知道有没有新的修饰，又进一步探索了DNA腺嘌呤羟甲基化的修饰。为什么要做这个呢？因为我们想探索腺嘌呤甲基化去甲基化机制，根据胞嘧啶去甲基化是taq酶氧化甲基生成羟甲基，类比过来，腺嘌呤甲基化也可能是类似的方法。

要验证这个通路，两个工作要做，第一要验证腺嘌呤羟甲基化是存在的，第二如存在，它是如何形成的。针对第一个问题，首先是鉴定，质谱鉴定的标准是有标准品，当然这个物质是没有现成标品的，只能合成。合成也很简单，拿到标品后，发现它在65度和95度不稳定，还不耐碱。为什么要做温度和ph值呢，因为在经典的方法中会涉及到这两个条件，这也可能解释了为什么之前哺乳动物没有检测到它的原因。

我们开发了中性的酶解方法，基本上和经典的酶解效果一样。酶解之后检测，在293细胞中检测到了羟甲基化修饰的腺嘌呤。后来在其他类型的细胞也检测到，含量大概是一百万个中包含少数几个。再结合分子生物学，最后证实了ALKBH1这个酶可以氧化甲基生成羟甲基。这些工作就把之前的四种修饰增加到六个。从这个工作衍生出其他新的工作。前面发展了中性酶解的方式，我们就可以除了探索已知的修饰方式，还检测到hm²G，这是一个新的修饰类型。前面发现ALKBH1可以氧化DNA的甲基生成羟甲基，引申发现ALKBH1这个蛋白可以氧化m³c，这个是2017年在RNA中发现的新修饰。

我们知道DNA去甲基化通路中的几种修饰类型，类比过来，RNA发现有甲基化和羟甲基化修饰，但没有发现醛基和羧基修饰，那RNA里面有没有呢？

我们用DNSH来标记，它可以跟醛基反应，生成吸附碱，带上苯环结构，从而提高质谱灵敏度。此外我们还可以用二氧化锰来氧化羟甲基生成醛基，这个方式可以同时分析内源性羟甲基化的修饰。用二氧化锰氧化分析的就是羟甲基和醛基，不氧化分析的就是内源性的醛基。从效果来说，标记之后灵敏度提高300多倍，用这种方法我们确实在哺乳动物中检测到了RNA的羟甲基化和醛基修饰。

发现了胞嘧啶的醛基，那这个醛基是否只有一种呢？我们想对核酸上醛基修饰进行系统研究。首先用GIRARD试剂进行标记，它可以跟醛基反应，把带电的基团接上去，之后用SPME，其带静电，可以将标记产物富集出来，这可以一箭双雕，去掉噪音，同时提高关注物质的“亮度”。用这种方法，我们检测到核酸上的六种醛基化修饰，其中有两种是新报道的。对于羧基检测，我们还是用溴乙酰基对它们进行同时标记，对标记试剂进行筛选，发现BDEPE效果最好。用BDEPE标记后，发现灵敏度提高、保留增强了。此外，我们还探索了它们在癌症中的含量，发现结肠癌和肝癌，癌症组织中羟甲基修饰都降低了。

探索mRNA里面的尿嘧啶5位甲基化修饰。目前发现A/G/C都有甲基化修饰，就是U没有发现，因为U在质谱上分析的离子化效率最低。我们设计了一个CMCT的标记，通过这种方式，我们想确认尿嘧啶5位甲基化修饰是否存在。其中高纯度mRNA的获得很重要，过程比较复杂。获得高纯度的mRNA后，用我们的分析方法来检测，发现这个修饰确实存在的。通过同位素示踪，发现甲基来自SAM，丰度大概是每一百万个几十个的水平。这个工作就在mRNA中发现了新修饰类型—m⁵U。

针对7位甲基化修饰的鸟嘌呤的研究。因为7位甲基化修饰的鸟嘌呤一般出现在哺乳动物或植物的5’端帽子结构，在RNA内部，不确定它有没有。主要原因是通常酶解是全部酶解了，不知道它是来自5’端还是来自内部。为了解决这个问题，我们筛选出一个可以酶解内部的修饰，不能酶解5’端帽子结构的酶和另外一种可以同时分解内部和5’端的酶。通过上述方法比较，就可以获得内部和帽子结构上的修饰信息。

下面是关于micro的修饰，前面mRNA、rRNA和tRNA都有研究，关于micro RNA的修饰研究不多。想要研究它的修饰，先要获得高纯度的micro RNA，我们建立了一个提取高纯度的办法。之后采用AB质谱，基于MRM的方法针对我们已知的修饰进行检测，结果检测到了24种修饰类型。这个工作就把之前micro RNA的少数几种修饰扩展到24种修饰类型，也发展了一个分段采集的模式从而提高灵敏度。

关于游离核苷酸的检测。主要针对的是核苷酸碱基上磷酸根的修饰。这种甲基化修饰的核苷酸到底在体内有没有呢？就用质谱来进行检测。检测时为提高灵敏度，我们用DMPA标记的试剂，它可以与氨基与磷酸根反应，从而提高灵敏度。看一下标记效果如何，A图是没有标记的，我们看到标准品保留是比较弱的，信号只有几百，B图是标记的，纵坐标是几千，通过计算，灵敏度提高了几十到几百倍。

灵敏度提高之后，我们就可以探索到底有没有甲基化修饰的核苷酸。在进行质谱分析之前，我们有一个样品前处理的富集过程。样品先过一个亲水SPE，富集出亲水核苷酸，然后进行标记，标记之后疏水性变强，再过一个疏水性SPE，保留我们想要的标记的核苷酸，最后进行后续的质谱分析。下图是质谱分析结果，我们看到5-甲基化的CMP和5-甲基化的dCMP。

我们现在解决了体内是否存在单磷酸修饰的甲基的核苷酸这个问题，但是并不完善，因为在DNA复制的过程中用的并不是单磷酸核苷酸，而是三磷酸核苷酸，所以说要证明通路的存在，必须证实三磷酸核苷酸的存在，下面我们就进一步解决这个问题。

先用质谱直接分析，发现只检测到了8种常见的没有修饰的三磷酸核苷酸——ATP、dATP、GTP、dGTP、CTP、dCTP、UTP、TTP，即没有检测到内源性的修饰的三磷酸核苷酸。因此我们的思路是增强灵敏度之后能否检测到。首先合成了新试剂8-DMQ，它含有重氮基团，可以和磷酸根进行特异性反应，这个反应条件比较温和，用这种方式我们在体内检测到了12种修饰的三磷酸核苷酸。然后用高分辨质谱进一步核对，检测到了5-甲基化修饰的-dCTP的存在。

那么这个甲基化修饰的来源是什么呢？我们推测它可能是来源于DNA或者是RNA的降解，即生成单磷酸核苷酸之后在酶的催化下生成三磷酸核苷酸。我们同样用同位素示踪的方式证实了这个推测。

通过这种方式，我们就把DNA或者RNA的这种修饰推测了它的通路，一个是经典的通过甲基转移酶的方式，把甲基加到DNA链上，另一个，因为我们检测到了内源性的单磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸的甲基化修饰，所以它有可能在DNA复制或者RNA转录的过程中，加上甲基化修饰。

我们今天主要是基于核苷酸的认识进行介绍，内容分三部分，分别是核苷酸修饰的背景介绍、核苷酸修饰方法的总结、关于质谱分析的核苷酸定性的研究。

1. 一个细胞，五个细胞是如何取样的？

答：用微操作的一个负压的吸管，把细胞一个一个的取出来，放到离心管里面去。另外，样品前处理提取核酸的时候，我们用的是一管法，避免核酸损失。

2. 您用的三重四级杆仪器型号？除了MRM模式，还用到什么模式扫描？

答：我这里讲的很多工作大部分是使用的AB的3200和4500，这是AB早期的仪器了，现在它出了灵敏度更高的型号，扫描模式主要是MRM和子离子增强型扫描模式。

3. 您讲到的衍生化试剂是不是还能应用于其他带磷酸根的物质？不局限与RNA和DNA？

答：可以。

4. 请问您检测到的这些DNA、RNA修饰有什么生物学意义？

答：核酸修饰功能最重要的就两个字，调控。核酸修饰不会改变核酸序列，但是会改变核酸的高级结构和核酸和蛋白结合的亲和力。所以作用是调控基因表达，调控生理功能。

5. 您能简单说一下质谱分析修饰RNA、DNA的定位的流程么？

答：质谱分析核酸修饰的定位可以做，但是目前分析不太多。它主要是对短的片段，例如十几个碱基、二十几个碱基进行定位分析。因为质谱可以对碱基序列进行打碎，分析二级谱图，所以可以对序列进行分析。缺点是现在没有商业化的数据库能去比对，需要手动解谱。

6. 核酸修饰质谱检测真正走到在临床上应用还有哪些挑战，测序也可以做DNA甲基化，未来二者在临床应用落地的发展趋势是怎么样的？

答：质谱在临床的应用，据我了解，很多医院现在用质谱做代谢物、蛋白质的检测。核酸修饰质谱检测应用于临床有哪些路要走呢，我个人认为可能要有规范化标准化的检测流程，再者就是标志物的判断，这就需要也建立一个标准。甲基化测序，技术也比较成熟了，在临床应用上还不是太多，现在更多的还是处于科研研究阶段。要想应用于临床，也需要建立标准。

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