项目文章 | 恭喜黄荷凤院士团队高脂饮食导致雄性后代肥胖和代谢紊乱机制研究喜登Mol Metab

（点击图片查看详情）

2020年12月，欧易/鹿明生物客户文章上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院黄荷凤院士团队、上海交通大学医学院胚胎源性疾病研究所及浙江大学医学院病理学与病理生理学系在《Molecular Metabolism》期刊发表的题为“Amylin receptor insensitivity impairs hypothalamic POMC neuron differentiation in the male offspring of maternal high-fat diet-fed mice”的研究成果，该研究通过建立高脂孕鼠和妊娠期超胰淀素小鼠模型，探讨了高脂膳食诱导胰淀素改变对雄性后代下丘脑神经元分化和代谢紊乱的影响，为研究调节胰淀素及其受体响应高脂膳食的具体分子机制提供了依据。

众所周知，母体高脂肪饮食（HFD）会导致后代成年后诱发的肥胖和代谢综合征，增加对2型糖尿病和心血管疾病未来发展的易感性。近年来，研究表明，妊娠期间的HFD可从胚胎发育期开始改变后代下丘脑的结构和功能。在下丘脑弓形核（ARC）中，含有两类调节能量代谢的神经元：一类是促进食欲的刺鼠肽相关蛋白（AgRP）神经元和表达神经肽Y（NPY），调节肌肉中的葡萄糖摄取和胰岛素敏感性；另一类是抑制食欲的阿黑皮素原（POMC）神经元，直接影响脂肪分解。POMC神经元通过释放阿黑皮素原的剪切产物促黑激素（alpha-MSH），一方面抑制食欲，另一方面通过调节交感神经系统的兴奋性来影响机体的能量耗散。总言之，下丘脑弓状核（ARC）是控制能量平衡和食物摄入的关键区域，也是糖脂代谢外周调节的核心。

研究表明，胰淀素是下丘脑中控制能量代谢和食物摄入的重要神经营养因子。胰淀素受体成分受体活性修饰蛋白（RAMP3）对胰淀素的亲和力最高，且RAMP3表达的改变与下丘脑神经元的调节有关。但就目前来看，需要更多的研究去关注RAMP3在下丘脑的表达或母体高脂饮食对RAMP3调节的特定分子机制。

研究材料

HFD和妊娠高胰淀素模型小鼠

检测材料

（1）生理生化实验：体重、食物摄入量、葡萄糖/胰岛素耐受量试验、胰岛素、瘦素、胆固醇和甘油三酯等含量检测

（2）功能验证实验：RNA pull down和RNA-IP检测与RNA结合的RNA以及蛋白质、qPCR检测mRNA表达水平，Western blot检测蛋白表达水平、免疫荧光染色观察形态学变化

1.母亲高脂饮食（HFD）增加体重，引起雄性后代的糖脂代谢紊乱

与母体正常饮食（NCD）相比，母体怀孕期间喂养高脂饮食（HFD）的雄性后代体重增加（图1B-E），而母体为HFD的雌性后代体重没有显著差异。断奶后，所有的后代都喂养NCD直到成年。研究发现经HFD喂食的雄性后代在断奶后往往比NCD的雄性后代有更多的食物摄入量（图1G）。然而，两组的雌性后代表现出相似的食物摄入量。喂食HFD的雄性后代在4周龄时显示出比NCD组更高的总胆固醇和胰淀素水平。在16周龄时，HFD组的雄性后代的总胆固醇、胰淀素、胰岛素、总胰岛素抵抗指数、甘油三酯和瘦素水平显著高于NCD组的雄性后代。通过GTT和ITT试验，16周龄HFD组的雄性后代表现出GTT和ITT的AUC显著增加（图1I，K），但在HFD组的雌性后代中并没有发现这种表型。 

图1 | 妊娠期HFD对雄性后代体重及糖脂代谢的影响

2.母体HFD导致成年后代下丘脑中POMC神经元减少和NPY神经元增加

免疫荧光测定结果显示，成年（16周龄）HFD组雄性后代下丘脑中NPY神经元的突触密度显著增加，而POMC神经元的突触密度显著降低（图2A，B）。qPCR结果表明，在16周龄的HFD组雄性后代中，NPY神经元中的Npy基因水平显著增加，而POMC神经元中的Pomc基因水平显著降低(图2C)。通过免疫印迹分析测得NPY和POMC蛋白表达水平一致（图2D-F）。

图2 | 妊娠期高脂饮食（HFD）对16周龄雄性后代下丘脑中NPY和POMC神经元水平的影响

3.妊娠期胚胎胰淀素水平对雄性后代代谢过程和下丘脑神经元的影响

从幼年到成年，HFD组的雄性后代的血清中胰淀素水平显著高于NCD组的雄性后代；HFD组胎盘中的胰淀素水平也高于NCD组（图3A，B）。通过建立妊娠高胰淀素模型，以确定妊娠期胰淀素对雄性后代代谢过程和下丘脑神经元的生理影响（图3C）。研究表明，怀孕期间用胰淀素处理的雄性后代的体重增加明显低于用生理盐水处理的5-16周龄的对照后代（图3E）。与对照组相比，胰淀素组的总胆固醇和甘油三酯水平在4周龄时保持相似，在16周龄时略有下降（图3F，G）；胰淀素组在4周龄时既不影响葡萄糖耐量也不影响胰岛素耐受性，而在16周龄时对葡萄糖和胰岛素更敏感（图3H-K）。

此外，与对照组相比，胰淀素组的POMC的mRNA水平和蛋白表达水平显著增加，而两组之间的神经肽Y的mRNA水平和蛋白表达水平却未观察到差异（图3L-O）。这些结果表明，在生理条件下，胰淀素可能在维持小鼠正常代谢中起重要作用。

图3 | 妊娠期胚胎胰淀素水平对雄性后代代谢过程和下丘脑神经元的影响

4.母体高脂饮食（HFD）导致胎儿下丘脑神经干细胞对胰淀素相关信号激活不敏感

作者认为，母体HFD可能会损害细胞对胰淀素信号的反应，这可能导致过度分泌胰淀素从而维持体内平衡，并在成年后影响下丘脑。为验证这一推论，作者通过qPCR检测了HFD组和NCD组雄性胎儿下丘脑中一系列与胰淀素受体相关的基因。HFD组中胎儿下丘脑的Ramp3基因显著减少（图4A），且RAMP3蛋白水平显著降低（图4B）。通过分离雄性后代下丘脑神经干细胞，以及检测胰淀素受体的受体后信号通路，胰淀素可以增加信号转导和转录激活因子3（STAT 3） 和胎儿神经干细胞中的细胞外调节蛋白激酶（ERK）磷酸化。然而，HFD组胰淀素诱导的STAT3和ERK磷酸化水平要明显低于NCD组（图4D-F）。

图4 | 妊娠期高脂饮食（HFD）对胎儿神经干细胞下丘脑胰淀素受体水平和胰淀素相关信号激活的影响

5.母体HFD诱导胎儿下丘脑神经干细胞Ramp3基因不稳定性

研究发现，虽然在HFD组中RAMP3的mRNA和蛋白水平显著降低，但在HFD组和NCD组中Ramp3的前体基因水平保持相似（图5A）。作者推断与Ramp3直接结合的蛋白可能会调节Ramp3的基因表达。通过RNA pull-down实验，利用生物素标记的RNA探针，确定了与Ramp3基因相互作用的是IGF2BP1蛋白（图5B，C），在NCD和HFD组的htNSCs中，通过RNA免疫沉淀试验，IGF2BP蛋白的抗体可以将Ramp3基因拉下来（图5D）。值得注意的是，IGF2BP1的蛋白表达水平也被证实在HFD组下调（图5E，F）。敲除或过量表达Ramp3后，IGF2BP1的蛋白质水平保持不变（图5G，H）。然而，在htNSCs中敲除IGF2BP1后RAMP3的表达显著下调，但在IGF2BP1过表达后保持相似（图5I，J）；这些结果证实IGF2BP1是htNSCs中RAMP3的负调节因子。

此外，作者还检测了Ramp3 mRNA和其前体mRNA的表达水平，发现敲除htNSCs中的IGF2BP1后Ramp3 mRNA水平显著降低，而Ramp3前体mRNA水平不受影响（图5K），表明IGF2BP1可能促进Ramp3 mRNA水平的稳定。为了验证该推论，使用放线菌素D对htNSCs进行RNA衰变分析，通过qPCR检测RNA降解情况。与用阴性对照shRNA转染的细胞相比，IGF2BP1的敲除导致Ramp3基因加速衰退（图5L）。这些结果表明下丘脑IGF2BP1和RAMP3的下调可能参与了母体HFD诱导的雄性后代肥胖的机制。

图5 |  IGF2BP1与Ramp3 mRNA相互作用，调节Ramp3在下丘脑神经干细胞(htNSCs)中的稳定性

6.RAMP3的下调损害POMC神经元的神经分化，而非NPY神经元

研究人员构建了体外培养系统，使得小鼠胚胎htNSCs中产生下丘脑神经元，包括POMC-MSH和NPY-AgRP（图6A）。然后在干扰Ramp3的表达后进行体外分化测定。在用对照shRNA处理的htNSCs中，胰淀素显著促进POMC-α-MSH神经元的分化，而在用RAMP3特异性shRNA处理htNSCs后，胰淀素对细胞的分化作用显著降低（图6B，C）。值得注意的是，用RAMP3特异性shRNA和胰淀素处理htNSCs，并没有改变NPY-AgRP神经元的分化。

如上所述，在htNSCs中Ramp3可通过结合IGF2BP1使之稳定；因此，在敲除IGF2BP1后，还检测了POMC-α-MSH神经元的体外分化效率。如图6F，G所示，与用shRNA转染的对照组相比，在用IGF2BP1特异性shRNA转染的敲除组中，胰淀素诱导的POMC-α-MSH神经元的分化效率明显降低。

图6 | 下丘脑神经元的体外分化

本研究旨在探讨胰淀素和RAMP3在妊娠期高脂喂养母鼠子代下丘脑神经元分化中的作用。作者利用HFD和妊娠高胰淀素模型小鼠模型阐明了RAMP3在母性HFD中调控的具体分子机制：

1) 母体高脂饮食降低了胎鼠下丘脑神经干细胞中IGF2BP1的表达水平，降低了IGF2BP1与Ramp3 mRNA的结合，使Ramp3  mRNA失去稳定性；

2) RAMP3相对表达量的降低导致胰淀素产生抗性，表现为胰淀素受体的受体后信号激活不敏感；

3) 胰淀素抵抗导致下丘脑神经干细胞分化为POMC神经元的能力受损，从而诱发了性别特异性代谢紊乱。

图7 | 母体高脂饮食导致雄性后代肥胖和代谢紊乱的可能机制

本研究表明，高淀粉酶血症可能与胎儿下丘脑Ramp3缺乏症后的淀粉酶积累有关。在下丘脑神经干细胞（htNSCs）中敲除Ramp3后，发现胰淀素不能促进食欲生成素-α黑素细胞刺激素（α-MSH-POMC）神经元的分化，但促进了食欲生成素相关蛋白-神经肽Y（AgRP-Npy） 神经元的分化。机制研究表明，IGF2BP1可在htNSCs中特异性与Ramp3 结合，并维持其Ramp3 mRNA的稳定性。HFD组htNSCs中IGF2BP1的下调可降低Ramp3的表达，导致α-MSH-POMC神经元分化受损。

本研究通过建立HFD和妊娠高胰淀素小鼠模型探讨下丘脑胰淀素和受体活性修饰蛋白3（Ramp3） 在调节子代代谢中的作用。采用RNA pull down、RNA免疫沉淀和RNA衰变分析方法，再通过LC-MS/MS质谱鉴定对Ramp3 mRNA pull down实验中洗脱的蛋白进行鉴定，从而研究母亲高脂饮食对胎儿下丘脑Ramp3缺乏症的影响机制。为探究母体高脂饮食（HFD）在后代中诱导ARC介导的性别特异性代谢疾病提供了研究策略及方法。

参考文献：

Parton, L.E., Ye, C.P., Coppari, R., Enriori, P.J., Choi, B., Zhang, C.Y., et al., 2007. Glucose sensing by POMC neurons regulates glucose homeostasis and is impaired in obesity. Nature 449:228-232.

Vogt, M.C., Paeger, L., Hess, S., Steculorum, S.M., Awazawa, M., Hampel, B., et al., 2014. Neonatal insulin action impairs hypothalamic neurocircuit formation in response to maternal high-fat feeding. Cell 156:495-509.

Huttelmaier, S., Zenklusen, D., Lederer, M., Dictenberg, J., Lorenz, M., Meng, X., et al., 2005. Spatial regulation of beta-actin translation by Src-dependent phosphorylation of ZBP1. Nature 438:512-515.

Huang, H., Weng, H., Sun, W., Qin, X., Shi, H., Wu, H., et al., 2018. Recognition of RNA N(6)-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation. Nature Cell Biology 20:285-295.

猜你还想看

◆新品上市 | 曾经错过热潮，别再错过新秀—空间代谢组

◆打破“次元壁”，飞升“空间代谢组学”新空间

◆空间代谢组学：中国医学科学院药物研究所再帕尔•阿不力孜团队：一种高灵敏、高覆盖质谱成像技术新进展

◆空间代谢组学：Science Bulletin | 空间脂质组学揭示怀孕小鼠暴露于PM2.5会导致子代小鼠认知和情绪障碍

◆空间代谢组学：PNAS | 空间分辨代谢组学方法揭示“下游代谢物与上游代谢酶关联”的癌症相关代谢变化

◆空间代谢组学：Plant Cell Environ. | 中国药科大学用质谱成像揭示银杏叶截面中独特的空间代谢组学

◆空间代谢组学：Theranostics | 定量质谱成像方法评估抗癌药物肿瘤靶向效率和瘤内分布异质性

END

Flora 撰文

欢迎转发到朋友圈

本文系鹿明生物原创

转载请注明本文转自鹿明生物