新视角 | “植物也中毒”有机酸的铝(Al)排斥机制研究

有机酸(OAs)在多种细胞生化途径中起着重要作用。OAs由植物根系释放，可以帮助它们耐受酸性土壤中存在的植物毒性形式的铝(Al)。2020年1月巴西保利斯塔大学B. M. de Oliveira Carvalho Bittencourt教授发表题为“Method to quantify aluminum-induced organic acids secretion by roots of plants in nutrient solution using GC–MS”的研究论文。使用GC-MS代谢组学测试了一种在含有不同Al浓度的完整营养液中定量柠檬酸，苹果酸，草酸和琥珀酸的方法。

有机酸(OAs)在几种细胞生化途径中起着重要作用，这些化合物可以调节植物对环境的适应。由植物根部释放的OAs可以帮助它们耐受酸性土壤中存在的植物毒性形式的铝(Al)。一些耐铝树种在根系环境中会响应铝而分泌柠檬酸，苹果酸，草酸和琥珀酸等OAs，与铝形成无毒稳定复合物。这避免了与质外体带负电部位的反应从而造成植物根中因铝导致的第一个损伤。

铝暴露与OAs分泌之间的时间依赖于物种。例如，在烟草中添加铝和开始分泌OAs之间没有延迟；荞麦和菠菜中草酸分泌的观察类似；在小麦中铝暴露15-30分钟后可检测到苹果酸分泌；另一方面，在蚕豆中，柠檬酸盐的分泌在3小时后可以观察到，并持续增加12小时；在黑麦中铝暴露与苹果酸和柠檬酸的分泌之间有6到10小时的延迟；而在决明子（豆科）中，柠檬酸盐的最大分泌发生在铝暴露后4小时。

以往所有描述OAs分泌的研究的主要局限性在于：OAs只在CaCl₂和AlCl₃溶液中测量，而非“完整”营养液，只能短期收集分泌的OAs。此外，大多数方法需要复杂的样品制备，包括许多步骤，例如以前的阴离子或阳离子交换树脂分离技术。CaCl₂和AlCl₃溶液中分泌OAs的定量通常采用高效液相色谱法（HPLC），更罕见的是离子色谱法。尽管有一些研究使用气相色谱-质谱（GC-MS）分析植物材料中的OAs含量，但利用气相色谱-质谱联用技术分析全营养液中分泌的OAs是很少见的。

1. 样品制备

营养液：选择了一种已用于测试对铝敏感的植物物种和耐铝植物中的Al效应的基于克拉克溶液化学成分的营养液。

样品制备：将含1 mLOAs的甲醇样品在70°C下完全烘干，仅将OAs沉淀物保留在样品瓶中。将含有45 mL营养溶液和OAs的样品在80°C的强制通风炉中完全干燥（OAs的挥发温度高于80°C）。然后，将其重新悬浮在甲醇中，并转移到3 mL样品瓶中，并在70°C下再次干燥，仅保留营养液中的OAs（作为沉淀物）和盐分。向仅包含OAs的样品中加入400  μL甲醇和100  μL硫酸。对于含有来自营养液中的盐的OAs的样品，添加700  μL的甲醇和300  μL的硫酸。将所有样品放在密闭的小瓶中（以避免损失任何体积）摇动15分钟，并在70°C下保持30分钟以催化反应。加入1 mL正己烷，并再次振摇后，收集100  μL非极性相（上清液），放置在带小瓶插入物的1.5 mL小瓶中，并使用GC-MS代谢组学进行分析。如下图所示描述了样品制备的分析阶段的步骤。

2.标准品溶液

在甲醇中制备四种标准OAs的储备液400 μg/mL，并通过甲醇稀释储备溶液获得相应的工作标准溶液5、10、30、50、100和200 μg/mL。

3.数据分析

利用简单的线性回归来模拟GC-MS峰面积与甲醇（校准曲线）和营养液（分析曲线）中OAs浓度之间的关系。使用Sigma Plot软件估算R²值，并通过R²的平方根计算R值。对于每种浓度（低，中和高）中的每种OAs（草酸，琥珀酸，苹果酸和柠檬酸），仪器的精密度和重复性值均由相对标准偏差（RSD）获得，相对标准偏差由重复样品及其样品之间的标准偏差之比计算得出。。

1.甲醇中六种浓度的OAs标准溶液的GC-MS色谱图

上图GC-MS代谢组学方法显示的色谱图具有足够的分辨率，在OAs浓度之间显示出不同的峰高，在草酸，琥珀酸，苹果酸和柠檬酸之间表现出不同的保留时间。不同的线条颜色代表不同的浓度（μg /m L）：黑色5，粉色10，蓝色30，棕色50，绿色70，深蓝色100。保留时间峰值：1草酸；2琥珀酸；3苹果酸；4柠檬酸。

2.校准曲线和分析曲线

从OAs的校准曲线获得的R²值在0.996和0.9994之间（表1；图3）。通过校准曲线的线性回归生成的模型的适应度显示，四个OA的测定系数（R²）高于0.9921。

添加到含有0、740和1480 μM Al的营养液中的标准OAs的分析曲线显示R²在0.9955和0.999之间（表1；图4）。通过分析曲线的线性回归生成的模型的适应度显示，OAs的R²高于0.9901（图4）。

表1 | 校准曲线和分析曲线的相关系数（线性）

图3 | 柠檬酸（a），苹果酸（b），草酸（c）和琥珀酸（d）的校准曲线

图4 | 在含有0（a）、740（b）和1480（c）μM Al的营养液中添加7种浓度的柠檬酸后的分析曲线

3.相对标准偏差的计算

用于测量仪器精度的相对标准偏差（RSD）值显示：低OAs浓度介于1.72和4.17之间，中OAs浓度介于1.03和2.03之间，高OAs浓度介于0.6和2.51之间（表2）。

测试营养物中OAs时用于测量方法重复性的RSD：对含0 μM Al的营养液，低OAs浓度，在0.43至3.55之间，对于中OAs浓度在0.27至1.27之间，对于高OAs浓度在0.2至0.33之间；在含有740 μM Al的营养液中，低OAs浓度的方法重复性的RSD值在0.95至18.53之间，中OAs浓度在0.15至4.99之间，高OAs浓度在0.65至1.82之间；在含有148 μM Al的营养液中，低OAs浓度时方法重复性的RSD值在3.14至15.42之间，中OAs浓度在0.3至2.36之间，高OAs浓度在0.06至4.12之间（表2）

表2 | 低，中和高浓度有机酸标准加入方法的仪器精密度和重复性

峰高和保留时间之间的比较表明，草酸，琥珀酸，苹果酸和柠檬酸在色谱图中可以区分。因此，使用GC-MS代谢组学的方法似乎足以评估目标OAs。

校正曲线表明所建立的方法和GC-MS参数能够检测，分离和定量OAs。校准曲线的线性回归显示最小R²为0.9921，表明模型具有足够的拟合度，并且所有OA的R²值均高于0.996。R值高于0.999表示回归线的理想数据拟合。通过在含有0、740和1480 μM Al的营养液中添加OAs建立的分析曲线显示最小R²为0.9901，表明模型具有足够的拟合度。在构建分析曲线时，绘制了所有值而不是平均值，结果得出所有OA的R²值均高于0.9955。因此，根据上述标准，分析曲线的R²值表明该方法具有足够的能力提供与添加有0、740和1480的营养液的样品中的OAs浓度成正比的结果。因此，所得方程可用于估计这些营养液中的OAs浓度。更重要的是，它证明了营养液中的盐和化学成分不会干扰OAs的检测和定量。

低（5 μg/mL），中（50 μg/mL）和高（200 μg/mL）OAs浓度的仪器精度的RSD值高达4.07％，表明本方法具有在这些条件下测量OA的足够精度条件（RSD<15%）。

本文研究了一种低成本，简单的方法来定量测定营养液中铝诱导植物根系分泌有机酸，包括几个简单的步骤，并且可以很好地提取和分离目标OAs。本文作者运用GC-MS代谢组学研究OAs的Al排斥机制提供了一个新的视角，从而使人们可以研究OAs的分泌高峰何时出现以及根系仍在分泌多长时间。

参考文献：

[1].Baetz U, Martinoia E (2014) Root exudates: the hidden part of plant defense. Trends Plant Sci 19:90–98

[2].Banhos OFAA, Carvalho BMO, Veiga EB, Bressan ACG, Tanaka FAO, Habermann G (2016a) Aluminum-induced decrease in CO2assimilation in ‘Rangpur’ lime is associ-ated with low stomatal conductance rather than low pho-tochemical performances. Sci Hortic 205:133–140

[3].Banhos OFAA, Souza MC, Habermann G (2016b) High alu-minum availability may affect Styrax camporum, a n A l non-accumulating species from the Brazilian savanna. Theor Exp Plant Physiol 28:321–332

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 栗子 撰文

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