Anal Chem | 中国医学科学院等用LC-MS质谱法开发异构体鉴定分析新策略

2021-01-28 11:16:40, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

鹿明

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前言

2020年3月5号由中国医学科学院药物研究所、北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室、中国民族大学等多家科研院校合作在Analytical Chemistry发表的题为：“Strategy for Global Profiling and Identification of 2- and 3-Hydroxy Fatty Acids in Plasma by UPLC-MS/MS“的研究，作者运用LC-MS代谢组学开发了预测模型，通过MRM作为定量方法，对2-羟基脂肪酸（2-OHFAs）和3-羟基脂肪酸（3-OHFAs）异构体鉴定，成功发现了6种OHFA组成的具有癌症良好诊断性能的潜在生物标志物，此研究为异构体的鉴定和分析提供了新的策略。

中文标题：通过UPLC-MS / MS技术对血浆中的2-和3-羟基脂肪酸进行整体分析和鉴定

材料：正常人和ESCC患者血浆

发表期刊：Analytical Chemistry

影响因子：6.35

发表时间：2020年3月5号

运用生物技术：LC-MS靶向代谢组学

研究背景

2-OHFAs是由脂肪酸2-羟化酶（FA2H）催化游离脂肪酸衍生的，被用于合成鞘脂和神经酰胺。2-OHFAs水平的改变与神经退行性疾病、肠炎和癌症相关。3-OHFAs主要在脂肪酸β-氧化过程中的水合步骤中形成。3-OHFAs在体液中的积累表明与线粒体脂肪酸β-氧化有关的疾病，包括遗传性的长链3-羟基酰基-CoA脱氢酶缺乏症和心脏缺氧等。

2-羟基脂肪酸（2-OHFAs）和3-羟基脂肪酸（3-OHFAs）具有相同碳骨架的异构体，两者均与脂肪酸氧化紊乱的疾病密切相关。由于2-OHFA和3-OHFA的结构高度相似，结构信息性产物离子较少和可用的区分标准非常有限，因此对2-OHFA和3-OHFA的全面分析仍然是一项挑战。本篇研究者开发了一种新策略，可通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS / MS），根据与结构相关的保留时间预测模型，对2-OHFA和3-OHFA进行分析和鉴定。

图 | 技术原理

实验设计

研究方法

1.分组和样品采集

对照组：健康血浆样品*50 ；实验组：ESCC（临床诊断）患者血浆样品*50；

2.标准品溶液

通过1mg/mL的2-OHFAs和3-OHFAs的标品储液配置标品。通过一系列稀释过程获得稀释比例为1、1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100和1/200的标准品溶液，将200ng/mL的3-羟基肉豆蔻酸甲醇溶液作为内标。

3.数据处理和统计分析

2-OHFAs和3-OHFAs的定性分析是在XalcBurc软件中进行的，依据MS/MS数据和保留时间被识别。为建立上述分析物的标准曲线，计算和绘制相似标准的标准曲线。多元线性回归分析采用SPSS软件，多元统计采用SIMCA-P软件。

实验结果

1.通过UPLC-Q-Orbitrap MS对2-和3-OHFA进行全面鉴定

研究者首先通过研究2-OHFAs和3-OHFAs的MS/MS裂解模式总结了它们的裂解规则，例如2-羟基葵酸和3-羟基葵酸，MS/MS谱图和裂解模式分析如图1所示。

图1 | 测试MS / MS谱图

2-羟基癸酸（A）和3-羟基癸酸（B）的MS / MS谱图 2-羟基癸酸（C）和3-羟基癸酸（D）的断裂途径。

根据上述裂解规则确定了碳链，可以从理论上计算出2-和3-OHFA的产物离子。根据这些产物离子生成了一个内部数据库，其中包含碳数范围为4至26、C=C键数（n，不饱和度）为0至6的2-和3-OHFA，数据库中列出了分子式和理论m / z值。如果产物离子与2-或3-OHFA的碎片图谱一致，则将该峰视为2-或3-OHFA候选物。

图2 | 候选物鉴定

（A）在合并血浆中鉴定出2-和3-OHFA（n = 0）的EIC；

（B）在合并血浆中鉴定出2-和3-OHFA（n = 1）的EIC；

*蓝色峰代表HMDB中记录的OHFA，红色峰代表新发现的OHFA。

尽管很难获得所有n-OHFA的标准品，但是n-OHFA的碎片化特征可以从文献中总结。作者发现3-OHFA的保留时间与其碳链长度之间的相关性很显著，回归系数为0.9933。此外，通过与真实标准进行比较，验证了线性预测模型中的六个3-OHFA，其准确度范围为96.9％至103.7％。使用碳数规则，鉴定出两个饱和的3-OHFA。作者利用以上确定的3-OHFA作为标准，进一步探讨了不饱和度与保留行为之间的关系。以碳数为22的3-羟基脂肪酸为例。尽管在血浆中未检测到FA（22：0）-3OH，但其保留时间可以通过回归方程式预测。

作者确定3-OHFA作为标准，构建了用于识别未知不饱和3-OHFA的三维（3D）预测模型如图3中所示。

图3 | 预测模型

（A）保留时间对3-OHFA（n = 0）链长的回归分析；

（B）保留时间对3-OHFA（碳数= 20和22）的C=C双键数目的回归分析；

（C）基于保留时间和3-OHFAs结构特征的多元线性回归拟合的3D预测模型。

*蓝点表示通过与标准品（A）进行比较确定的3-OHFA，或代表通过模型A和模型B（B / C）鉴定的3-OHFA；

*绿点代表新近确定的3- OHFA；

*灰点表示由预测模型预测的虚拟3-OHFA。

如图4B所示，当碳数恒定时，C=C双键的数目与保留时间负相关，并且在合并的血浆中鉴定出五个新的不饱和3-OHFA。

图4 | 不饱和3-OHFA鉴定

（A）保留时间对2-OHFA（n = 0）链长的回归分析；

（B）3-OHFA的保留时间相对于具有相同碳链的2-OHFA的保留时间的回归分析；

（C）通过（B）中的线性模型对新发现的不饱和2-OHFA进行3D可视化。

*红色圆点表示通过标准识别的2-OHFA；

*黄色圆点表示通过商业标准验证的2-OHFA；

*紫色圆点表示通过商业标准验证的2-OHFA和3-OHFA之间的关系；

*灰色圆点表示在HMDB中记录的商业标准的2-OHFA 不可用；

*蓝点代表3-OHFA。

2.定量方法开发和验证

为了全面准确地分析2-和3-OHFA，将UPLC-Q-Orbitrap MS在合并血浆中鉴定出的所有OHFA移至UPLC-Q-Trap MS上的MRM模式进行定量分析。由于两个设备都连接到相同类型的UPLC系统，因此可以将梯度洗脱程序直接应用于定量方法。并通过标品，优化MRM参数。

为了评估定量性能，使用20个2-和3-OHFA标准品仔细进行了验证实验，包括准确性，精密度，提取回收率和稳定性。所有OHFA均表现出优异的线性，回归系数大于0.99。QC样本（低，中和高）的准确性均在89.11％至107.94％之间，日内和日间的RSD分别为2.05％至12.74％和3.38％至10.32％。在三个不同的水平上，OHFA的回收率均高于87.18％。此外，制备后的稳定性研究表明，OHFA在4 ℃下48小时内具有良好的稳定性。

综上所述，所开发的方法被证明对OHFA定量是可靠的，具有良好的线性、准确性和稳定性。

3.ESCC患者和健康对照组中2-和3-OHFA的代谢谱分析

为了了解癌症中羟基脂肪酸的代谢，作者收集了50个ESCC和50个健康对照的血浆样品，并通过建立的定量分析方法进行了分析。合并血浆样品的EIC示于图5A。在血浆中检测到18种2-OHFA和32种3-OHFA并进行了定量。如图5B所示，在OPLS-DA评分图中，ESCC患者与健康对照明显分离，表明羟基脂肪酸代谢异常与ESCC的发生有关。VIP>1和P<0.05的OHFA被认为是ESCC的潜在生物标志物。进行深入的ROC分析以评估其诊断能力。

图3 | LC-MS代谢组学定量分析

（A）在合并血浆样品中鉴定出的2-OHFA和3-OHFA的EIC；

（B）基于ESCC和健康对照的2-和3-OHFA浓度的OPLS-DA得分图；

（C）由六个区分性OHFA组成的面板的ROC曲线；

（D）ESCC和健康对照之间潜在的OHFA生物标志物的箱形图。

实验结论

在此研究中，开发了一种基于UPLC-MS / MS对OHFA进行鉴定和识别的新策略。该方法显著提高了OHFA的覆盖范围，并根据有限的标准色谱特征色谱保留时间规则识别2-和3-OHFA。通过仔细研究保留时间和碳链结构之间的关系，以及羟基位置诱导的异构体保留时间移动规则，建立并验证了一个预测模型，该模型利用了异构体的结构特征。

使用LC-MS代谢组学方法，首次在血浆中同时鉴定和测定了18种2-OHFA和32种3-OHFA，其中新报道了27种。该策略能够以很少的产物离子鉴定未知的代谢物，并为靶向代谢组学（尤其是异构体代谢物）提供了新的平台。

进一步的定量分析应用于ESCC血浆中的OHFA谱，其中六个OHFA显示异常变化，表明OHFA与癌症发展密切相关。该方法是鉴定新的OHFA的有力工具，可对OHFA代谢进行系统的研究，并可用于发现与疾病相关的生物标记。

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本文探索了对2-OHFA和3-OHFA这两种结构相似、结构信息产物少的两种脂肪酸衍生物的区分。研究者确定了通过结构依赖性的保留时间预测模型、运用超高效液相色谱-质谱串联来分析和鉴定2-OHFA和3-OHFA的策略。通过该策略，研究者通过MRM开发了定量方法，并将其应用于ESCC患者体内2-OHFA和3-OHFA的定量检测，成功发现了6种OHFA组成的具有癌症良好诊断性能的潜在生物标志物。

此研究为异构体的鉴定和分析提供了新的策略，展示了靶向代谢组学在临床生物标志物发现中的巨大潜力。这篇文章通过策略创新，实现对新2-OHFAs和3-OHFAs的识别，并开发了强大的定量工具，十分值得借鉴。