Food Chemistry | 运用GC-MS/LC-MS代谢组学研究黄酮类化合物在大鼠体内吸收代谢

2020年，伊利诺伊大学食品科学与人类营养系课题组在Food Chemistry杂志（IF=5.399）发表题为“A comparison of the absorption and metabolism of the major quercetin in brassica，quercetin-3-O-sophoroside，to that of quercetin aglycone, in rats”的研究论文。该研究运用LC-MS代谢组学及GC-MS代谢组学技术以罗布麻中提取的槲皮素-3-O-槐苷为原料，采用大鼠原位肠道模型，对其吸收、Ⅱ期代谢及微生物分解代谢进行了研究，并与槲皮素苷元进行了比较。

黄酮类化合物因其在预防慢性疾病（包括心血管疾病和癌症）中促进健康的作用而被广泛认可。槲皮素是一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于植物性食品和饮料中。与大多数黄酮类化合物一样，槲皮素通常以多种糖苷形式存在于自然界中，而不是以游离苷元的形式存在。槲皮素-3-O-槐苷（QS）是人们特别感兴趣的一种黄酮类化合物，它是西兰花中的一种主要黄酮类化合物，而西兰花是公认的抗癌和抗炎食品。

近年来，食品与微生物之间的相互作用越来越引起人们的兴趣。所有类型的黄酮苷类都会部分转移到肠道下部，在那里宿主体内缺乏的微生物酶会进行广泛的分解代谢。微生物分解代谢包括槲皮素苷的脱糖基化为苷元，随后发生环分裂，导致形成多种生物活性酚酸，包括苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸衍生物。

本研究以罗布麻中提取的槲皮素-3-O-槐苷为原料，采用大鼠原位肠道模型，对其吸收、Ⅱ期代谢及微生物分解代谢进行了研究，并与槲皮素苷元进行了比较。

1.实验设计

从Envigo公司购买体重范围140-160克的Fischer 大鼠344只，单独关在笼子里，食物和水可随意摄取。对大鼠进行为期6天的AIN93G粉末饮食的适应。手术前12小时饮食被取消。

通过空肠或盲肠给药（每组n=3~4）给每只大鼠注射QS或槲皮素苷元，收集门静脉血并分析其代谢产物。对于空肠给药，从空肠近端开始约20cm的节段通过结扎关闭。然后将15μmol槲皮素苷元或QS溶解在0.5ml丙二醇中，用2% DMSO溶解在结扎段的近端。注射后，取出针，近端立即结扎，形成封闭的空肠段，两端结扎。盲肠给药时，结扎整个盲肠，并在完全结扎前从结肠（远端）端引入材料。

在材料导入之前，将导管插入门静脉（离肝脏约2cm远）以收集血液。在空肠给药后10、20和30分钟，盲肠给药后0、60、90、120和150分钟，用含60μl 2%EDTA的1 ml注射器抽取血液（600μl），以防止血液凝结。根据初步数据（未显示）选择时间点。手术后，对空肠给药的大鼠，从体内取出空肠段，精确测量长度（19–24 cm）；对盲肠给药的大鼠，收集盲肠内容物，并在-80°C下冷冻，直到分析。手术后立即将血样保存在冰上并离心收集血浆。

2.检测方法

从血液样本中制备血浆，以2400rpm/min（500×g）的速度离心15分钟，在4°C下离心两次，然后在-80°C下冷冻，直到分析。使用三体积的含有0.1%甲酸的甲醇提取约300μL的血浆样品。该混合物在10分钟内每2分钟涡旋30秒，在16100×g离心10分钟后，在氮气下将上清液（约1.2毫升）浓缩至约100μl。再离心后，测量上清液的体积，在LC-MS上进行定性分析，并分别在HPLC-PDA上进行定量分析。

盲肠内容物冷冻干燥。测量100 mg干燥样品并在70%甲醇中浸泡。将样品在18000×g下离心10min，重复超声30秒，45秒，蒸发干燥，用100μl N-三甲基硅基-N-甲基三氟乙胺（MSTFAA）衍生，进行酚酸的GC-MS分析。

采用图基多重比较试验（family wise α= 0.05）对酚酸测定的对数转换数据（base e）进行单因素方差分析。用Shapiro-Wilk检验正态分布（p≤0.05），用Brown-Forsythe检验方差齐性（p<0.05）。使用GraphPad Prism8进行分析。

“槲皮素-3-O-槐苷（QS）的吸收与Ⅱ期代谢”，空肠引入QS后，完整的QS和QS的四个II期代谢物均在门脉血浆中被鉴定（表1和图1）。

表1 | 所有II期代谢产物的完整列表

图1 | 引入槲皮素苷元或槲皮素-3-O-槐苷（QS）后血浆II期代谢物的色谱图

这四种代谢产物包括硫酸QS（峰10）、甲基化QS（两种异构体，峰13和峰14）和甲基化QS硫酸盐（峰11）、两种典型的Ⅱ期代谢活性产物、甲基化和硫酸化。另一个典型的II期代谢产物QS-葡萄糖醛酸没有被观察到，也没有任何去糖基化产物，如槲皮素苷元、槲皮素-3-O-葡萄糖苷或其II期代谢产物。空肠手术30分钟后每10分钟测定一次血浆QS的丰度（表2）。

表2 | 引入槲皮素苷元或槲皮素-3-Osophoroside（QS）后，对血浆中选定的II期代谢物进行量化并进行标准统计表

血浆Qs浓度随时间延长，血浆中最大浓度为3.7±1.2μm，盲肠导入QS后，150 min时门静脉血浆中无代谢产物或QS，无吸收。

表3 | 原位盲肠导入150分钟后槲皮素苷元和槲皮素-3-O-槐苷（QS）的分解代谢统计

表3是原位盲肠导入150分钟后槲皮素苷元和槲皮素-3-O-槐苷（QS）的分解代谢统计。由表3可以看的出苷元组和QS组之间的分解代谢模式没有差异，除了间苯三酚，它只在苷元组观察到。

本研究成功地从罗布麻中分离出了纯QS，并用MS2、1H NMR 和13C NMR对其结构进行了确证，比较了槲皮素及其苷元的吸收、Ⅱ期代谢和微生物分解代谢。随着罗布麻中黄酮类化合物QS的成功纯化和大鼠原位模型的建立，作者首次报道了黄酮类化合物在小肠中被完整吸收，在空肠中被代谢为硫酸、甲基化和甲基化硫酸盐。

作者的数据表明，QS可能被盲肠微生物群脱糖基化为苷元，形成苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸的衍生物，表明QS与微生物群之间存在着积极的相互作用。新的发现表明，QS在上消化道完全吸收而没有去糖基化，这表明终糖和（或）糖苷部分之间的连接类型可能在类黄酮糖苷的吸收机制中起作用。如果吸收涉及SGLT1或GLUT所属类型则需要进一步的研究来确定通过空肠壁吸收QS的转运系统，正在进行的研究表明，通过一些黄酮类化合物与这些转运蛋白结合可能抑制糖的摄入，为糖尿病和肥胖症的控制提供了新的见解。

本文作者运用LC-MS代谢组学和GC-MS代谢组学对槲皮素苷与槲皮素苷吸收、Ⅱ期代谢及微生物分解代谢进行了研究，并与槲皮素苷元进行了比较。作者发现了QS可能被盲肠微生物群脱糖基化为苷元，形成苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸的衍生物，表明QS与微生物群之间存在着积极的相互作用。QS在上消化道完全吸收而没有去糖基化，这表明终糖和（或）糖苷部分之间的连接类型可能在类黄酮糖苷的吸收机制中起作用，通过一些黄酮类化合物与一些转运蛋白结合可能抑制糖的摄入，为糖尿病和肥胖症的控制提供了新的见解。这篇文章应用到了LC-MS/MS和GC-MS代谢组学现代最流行的质谱技术，十分值得借鉴。

部分文献参考

1.Jeffery,E. H., & Araya, M. (2009). Physiological effects of broccoli consumption. Phytochemistry Reviews, 8(1), 283–298.https://doi.org/10.1007/s11101-008-9106-4.

2.Lai, R.-H., Miller, M. J., & Jeffery, E. (2010). Glucoraphanin hydrolysis by microbiota in the rat cecum results in sulforaphane absorption. Food & Function, 1(2), 161–166.

https://doi.org/10.1039/c0fo00110d.

3.Liu, X., Wang, Y., Hoeflinger, J. L., Neme, B. P., Jeffery, E. H., & Miller, M. J. (2017).

Dietary broccoli alters rat cecal microbiota to improve glucoraphanin hydrolysis to

bioactive isothiocyanates. Nutrients, 9(3), https://doi.org/10.3390/nu9030262.

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Dragon 撰文

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