Nat commu | "深度揭底"大样本DIA磷酸化修饰蛋白组学定量技术

定量磷酸化蛋白质组学已经改变了细胞信号传导的研究，但将其应用于高通量分析仍具有挑战性。本篇由哥本哈根大学健康与医学科学院蛋白研究中心Jesper V. Olsen团队在Nature communications杂志（IF=11.878）发表题为“Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries”的研究论文，该研究优化了DIA磷酸化蛋白质组学数据分析流程，并系统分析了激酶抑制剂对磷酸化蛋白质组的作用。

位点特异性蛋白磷酸化是最重要的翻译后修饰之一，失调的磷酸信号是癌症和许多其他疾病的标志。然而，大多数磷酸化蛋白质组学研究通常需要通过LC-MS / MS进行数天甚至数周的测量，分析少数具有足够深度的细胞条件，来鉴定功能性磷酸化位点。而且，当前系统可重复性地分析大量样品中的磷酸化位点仍具有挑战性，这限制了如药物筛选在内的大样本磷酸化的高通量应用。

为了解决这些问题，作者开发了一种优化的非标磷酸化蛋白质组学方法，该方法结合了LC-MS / MS与DIA。这种方法能够系统地、可重复地分析数百个样品中的10,000多个磷酸化位点。此外，作者开发并采用算法来准确定位DIA数据集中的磷酸化位点，确定其在系统范围内的化学计量分数，运用此技术来确定表皮生长因子信号通路的十种主要蛋白激酶的磷酸化位点目标。

1.比较DDA和DIA定量磷酸化蛋白质组学

为了进行高通量磷酸化蛋白质组学研究，必须减少输入蛋白的量，提高工作流程的可重复性，并减少质谱仪的使用时间。因此，基于高通量磁性Ti-IMAC磁珠从200μg起始胰蛋白酶肽材料中富集的磷酸肽，优化了可扩展的单次分析工作流程，使用Q Exactive HF-X质谱仪上的快速28 Hz高能碰撞解离（HCD）扫描方法在15分钟的LC-MS / MS分析时间内例行定量〜7000个磷酸肽，总体识别率超过50％。

图1 | DDA和DIA磷酸化蛋白质组学鉴定和定量

此外，作者通过调整参数设置优化了仪器设置从而获得最佳DIA性能，将均方误差（MSE）计算作为每种方法的正偏差和方差之和，分别代表准确性和精度上的定量误差，以更好地评估定量精度，使用SAM检验的显著性d得分来计算DIA 的正阳性率（TPR）和假阳性率（FPR），以测试DIA的准确和精确量化是否可以更好地识别。

2. DIA特异的磷酸化位点定位算法

作者使用标准DDA数据中不可用的信息开发了一种PTM本地化算法，用于以肽段为中心的分析。这包括碎片离子的完整同位素图谱，以及生成与目标前体峰形相关的短洗脱色谱图的可能性。后者允许系统地去除DDA中无法解决的任何干扰碎片离子。将这两个方面与基于碎片离子强度和质量准确度的其他评分组合成每个片段的特定加权评分，然后将其用于计算特定的位点定位评分。

3.生物环境中DDA和DIA的技术比较

接下来，作者评估了DIA中局部磷酸肽相对于DDA的增加覆盖是否在细胞信号研究中转化为优势，使用经不同MEK激酶抑制剂处理的EGF刺激的视网膜色素上皮细胞（RPE1）作为模型系统，并通过DDA和DIA用15分钟的梯度进行分析。

图2 | 在生物环境中DDA和不同类型DIA的技术比较

4.分数磷酸化位点化学计量分析

除了对磷酸化位点进行相对定量之外，确定其占有率或绝对化学计量也很有价值。高分数化学计量学与动态调节相结合是该位点在研究的细胞环境中起作用的有力证据。有可能通过使用在这两个磷酸肽，其非磷酸化的对应肽和从SILAC数据处理条件之间的相应的蛋白观察到的比例，以确定大规模磷酸化位点的分数化学计量和TMT-复用数据。

图3 | 控制比例实验工作流程

5.使用激酶抑制剂的大规模磷酸化蛋白质组学

为了证明此处开发的基于DIA的快速位点特异性磷酸蛋白质组学工作流程的强大功能和可扩展性，作者使用30种激酶抑制剂将其应用于表皮生长因子信号通路中的十种主要蛋白激酶的磷酸化位点靶标。

图4 | 激酶抑制剂筛选

本文作者基于DIA优化了磷酸化蛋白质组学工作流程，用一种快速且可重复的方法，独立获取（DIA）分析数百个磷酸化蛋白质组。与目前先进的基于数据依赖采集（DDA）的磷酸化蛋白组学相比，基于DIA的磷酸化蛋白组学具有更宽的动态范围、更高的鉴定重复性和更高的定量灵敏度和准确性。并开发了PTM本地化算法作为DIA计算的一部分，以此作为磷酸化蛋白质组学的基准。通过分析合成磷酸肽，显示了基于DIA的磷酸化蛋白质组的特异性和高质量。此外，使用基于DIA的无标记定量技术系统分析了激酶抑制剂对磷酸化蛋白质组的作用。

本文优化并简化了DIA磷酸化蛋白质组学数据分析流程，提供了很多仪器设置参数以供借鉴，开发了PTM本地化算法，对我们DIA磷酸化技术改进很有帮助。

部分文献参考

1.Olsen, J. V. & Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics 12, 3444–3452(2013).

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3.Bruderer, R. et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol. Cell. Proteomics 14, 1400–1410 (2015).

4.Kelstrup, C. D. et al. Performance evaluation of the Q exactive HF-X for shotgun proteomics. J. Proteome Res. 17, 727–738(2018).

5.Hoffman, N. J. et al. Global phosphoproteomic analysis of human skeletal muscle reveals a network of exercise-regulated kinases and AMPK substrates.Cell Metab. 22, 922–935 (2015).

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百香果 撰文

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