Hepatology | 运用16S+靶向代谢组学可区分重度饮酒和酒精性肝炎患者

2020年2月，Hepatology（IF=14.971）医学一区胃肠肝病学1区期刊发表题为“Fecal microbiome distinguishes alcohol consumption from alcoholic hepatitis but does not discriminate disease severity”的研究论文，该研究基于16S rRNA基因测序和LC-MS靶向代谢组学技术，提供了因重度饮酒而引起的粪便微生物组变化以及与酒精性肝炎相关变化的新信息，也提供了关于粪便微生物组与疾病发展之间的新见解。为酒精性肝炎疾病的治疗提供新的思路，也可作为相关研究的借鉴。

酒精性肝炎（AH）是酒精性肝病（ALD）的一种，死亡率高、预后效果差，现有的治疗方法（如类固醇）效果不佳。在酒精性肝炎发展之前，需要持续高水平饮酒（每天饮酒40-60克以上），然而仅部分人会发展为酒精性肝炎。因此除了酒精肝毒性外，其他因素也可能影响酒精性肝炎的发作和发展。最近的研究集中于肠道微生物组，是几种肝病发展的关键因素。肠道细菌的数量和质量变化，与ALD的发展以及肝硬化相关，但在确定性酒精性肝炎病例中，尚缺乏足够的数据来确定粪便微生物组是否有明显变化。本文作者使用16S rRNA基因测序和粪便靶向代谢分析，以鉴定因大量饮酒而导致的疾病微生物特征，并将微生物生态学的变化与疾病的严重程度进行关联，推断微生物生态学变化与疾病严重程度的功能相关性。  

1. 实验分组

78名参与者分为四组，健康对照组（HC，n = 24）、重度饮酒对照组（HDC，n = 20）、中度酒精性肝炎患者（MAH，n = 10）和重度酒精性肝炎患者（SAH，n = 24）。

2. 粪便微生物组分析

16S rRNA基因测序、多标签测序（MTS）、主坐标分析（PCoA）、PICRUSt分析、随机森林分类和回归模型分别建立酒精性肝炎和MELD评分的预测模型。

3.粪便短链脂肪酸靶向代谢组学分析

使用LC-MS平台从重度饮酒对照和酒精性肝炎患者的粪便样品中测量SCFA浓度，使用韦尔奇（Welch）双样本t检验确定HDC和AH患者之间显著差异。

1.饮酒导致粪便微生物组组成发生变化

为了考察饮酒的影响，作者首先比较了重度饮酒对照组和健康对照组的微生物分类情况。与健康对照相比，重度饮酒对照组富含厚壁菌但拟杆菌明显减少，厚壁菌与拟杆菌的比值更高（图1 A-C） 。尽管酒精性肝炎患者的厚壁菌与拟杆菌比值比健康对照组高（图1D），但厚壁菌丰度在重度饮酒对照组中逐步下降，与中度酒精性肝炎患者相同，接近重度酒精性肝炎患者（图1E-F）。从健康对照组到重度饮酒对照组和中度酒精性肝炎组，变形杆菌的比例适度增加；重度酒精性肝炎患者的变形杆菌种群增加更多。

图1 | 饮酒对粪便微生物种群的影响

2.酒精性肝炎的发展与粪便微生物组明显变化有关

（1）不同样本多样性差异显著

四个组的总体香农α多样性差异显著（图2A），但健康和重度饮酒对照组之间没有显著差异，中度酒精性肝炎组多样性有减少趋势，在重度酒精性肝炎中进一步加剧。对照（HC和HDC）和肝炎（MAH和SAH）患者在PCoA图（图2B）上明显分开，表明尽管对照和疾病组微生物组组成相似，但对照组和酒精性肝炎是不同的。因此酒精性肝炎的发展与微生物成分的明显变化有关。

图2 | 四个组的微生物多样性结果

（2）饮酒和酒精性肝炎引起的微生物组变化有差异

直方图中显示了特定细菌在家族和属水平上的差异富集（图3）。重度饮酒对照组粪便中富含肠杆菌科、乳酸杆菌科、葡萄球菌科等，健康对照组则富含酸氨基球菌科、拟杆菌科、丹参科等多个属。

图3 | 不同样本中特定细菌在家族和属水平上的差异

作者使用K-fold交叉验证的随机森林分类模型对单个微生物组的判别能力进行排名。图4A显示了重度饮酒对照组和酒精性肝炎组中前20个分类单元相对丰度。虽然区别最大的分类单元相对丰度水平较低，但仍能观察到韦荣球菌属和拟杆菌属是酒精性肝炎最丰富的分类单元，而毛螺旋菌属是重度饮酒对照组最丰富的类型。仅根据微生物组组成即可将酒精性肝炎与重度饮酒控制区分开，且预测准确性相对较高（模型AUC = 0.826，图4B）。

图4 | 重度饮酒对照组和酒精性肝炎组相对丰度

（3）经治疗后的酒精性肝炎患者的粪便微生物组变化

主成分协调分析的β多样性图表明，重度酒精性肝炎患者接受己酮可可碱和类固醇治疗后，不同药物治疗的患者粪便微生物组有差异，但这些差异并没有加强重度饮酒对照与酒精性肝炎组之间的总体差异，将这些患者删除，仍可将重度饮酒控制与酒精性肝炎患者区分开。

（4）肠道微生物组组成不能区分疾病严重程度

为进一步研究微生物组成是否与酒精性肝炎的严重程度相关，作者研究了粪便微生物成分与酒精性肝炎严重程度之间的关系，使用MELD评分作为潜在酒精性肝炎的替代指标。结果表明，肠道微生物组成不足以区分轻度至中度酒精性肝炎。随机森林回归评估微生物群和MELD评分之间的联系，发现该模型不具有显著性且关联性较低，表明尽管微生物组组成随酒精性肝炎的发展而变化，但它并不是疾病严重程度的预测指标。

3. 菌群分类组成差异与粪便代谢物之间的联系

为了推断微生物生态学变化与疾病严重程度的功能相关性，作者运用LC-MS靶向代谢组学分析了目标粪便代谢物——短链脂肪酸（SCFA），以表征分类学分布和粪便微生物群差异的功能结果。短链脂肪酸的已知作用有：肠上皮屏障的完整性，肠道和全身性炎症反应，包括肝炎和肝代谢。而酒精性肝炎与毛螺旋菌科和瘤胃球菌科家族的显著减少有关（图3，第2列和图5a），它们是肠道中SCFA的生产者。与HDC相比，SAH患者粪便中检测到的所有SCFA均显著降低（图5b）；而MAH患者其中3种粪便代谢物显著降低，即异丁酸酯，2-甲基丁酸酯和异戊酸酯。但MAH和SAH之间的粪便SCFA浓度没有显著差异。

与HDC相比，除毛螺旋菌科和瘤胃球菌科之外，可产生SCFA的链杆菌属在SAH也减少了，但在MAH没有减少。与HDC相比，MAH和SAH中均富含可以产生SCFA的细菌韦荣氏球菌科的韦荣氏球菌和巨型球菌。

图5 | 粪便中靶向代谢物短链脂肪酸（SCFA）的定量结果

4.饮酒受试者的肠道基因组功能

作者预测了与饮酒和酒精性肝炎相关的肠道基因组的功能潜力。如图6所示，随酒精消耗代谢途径数量减少。健康对照组的多种氨基酸代谢途径含量丰富。而大量饮酒对照组，只有色氨酸代谢途径较为丰富。在碳水化合物途径中，健康对照组中富含氨基糖和核苷酸糖以及淀粉和蔗糖代谢，而饮酒人群中富含抗坏血酸\\醛糖酸盐代谢和丙酸酯代谢；健康对照组中富含鞘脂代谢，而大量饮酒者富含脂肪酸和不饱和脂肪酸的生物合成途径。健康对照组富集了多条能量代谢途径，该组中大多数异种生物通路也较丰富。中度酒精性肝炎和重度酒精性肝炎相比，两组的代谢途径均未显著差异。

图6 | 不同组之间代谢途径的异同

肠道微生物组在酒精性肝病的发生中起重要作用，但是微生物成分无法区分中度和重度酒精性肝炎。本研究通过16S rRNA技术发现酒精性肝炎患者的微生物多样性下降，靶向代谢组学验证，此过程伴随着功能降低。重度饮酒对照组所观察到的多样性下降，意味着多种正常功能丧失，降低保护肝脏与伤害性因素平衡的可能性，从而增加对酒精性疾病的易感性。

与重度饮酒对照组相比，酒精性肝炎患者螺菌和瘤胃菌属显著减少，它们可生产SCFA。靶向代谢组学技术分析SCFA结果表明，酒精性肝炎的SCFA降低，同时产生SCFA的微生物菌水平降低，提示了这些变化的潜在病理作用。

另一个值得注意的发现是，临床确诊的粪便微生物组成种群不均一。重度饮酒对照组几名患者的微生物组成与酒精性肝炎患者相似。也有几例中度或重度酒精性肝炎患者的微生物组与重度饮酒对照组相似，意味着根据粪便微生物组，在临床定义为酒精性肝炎人群中可能存在着亚群，需要更深入地研究。

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