ARD | 风湿病顶级期刊！体外质谱技术揭示银屑病关节炎滑液的骨髓促炎特征

2022-10-12 17:58:26, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

前言

银屑病关节炎（PsA）与许多免疫细胞群的发病机制有关，目前已知PsA与CD8+T细胞（尤其是产生IL-17）有关。本篇研究通过质谱流式细胞术（CyTOF）结合转录组学技术，测量PsA、SF和血白细胞的高维数据集，并鉴定炎性蛋白（骨桥蛋白和CCL2）。无任何体外刺激条件下定量分析SF蛋白，以确定髓源性介质在PsA发病机制中的作用。

2021年12月,由英国牛津大学纳菲尔德骨科、风湿病学和肌肉骨骼学院Nicole Yager、Paul Bowness教授课题组在国际风湿病顶级期刊Annals Of The Rheumatic Diseases期刊（IF:27.973）发表了题为 “Ex vivo mass cytometry analysis reveals a profound myeloid proinflammatory signature in psoriatic arthritis synovial fluid”的研究成果，通过质谱流式细胞术和转录组学研究方法，发现了骨桥蛋白和CCL2的特征，探究了PsA的炎症机理，描绘了PsA SF和血液的综合细胞图谱。为PsA诊断和治疗提供了理论依据。

研究思路

研究方法

1、实验分组/研究材料

（1）实验组：11名（6名男性，5名女性，未接受生物DMARDS或类固醇治疗的连续患者，4名甲氨蝶呤治疗的患者）采集血液和SF；其中3名患者进行PCR阵列评估，3名患者进行scRNA测序，另外3名患者进行靶向SF和血浆蛋白分析

（2）对照组：15名健康者（10名男性，5名女性）采集血液

2、技术路线

2.1细胞因子染色和分析: Maxpar、ConsensusClusterPlus和FlowSOM法

2.2 PCR阵列：RNeasy Micro kit（Qiagen）、定制384基因阵列（RT2）、ΔΔCt方法计算SF血样

2.3 定量骨桥蛋白：LEGENDplex、人骨桥蛋白ELISA

2.4 scRNA测序分析：Seurat识别分析聚髓细胞簇

3、统计分析

Benjamini-Hochberg、Wilcox、BioLegend

研究结果

1. 与PsA血相比，PsA SF显示特异性髓细胞量显著增加

对11名PsA患者的SF和血液进行细胞因子分析，通过主成分分析（PCA）可显著区分PsA、SF样品与血液（图1）。无偏聚类算法FlowSOM观察到细胞间的明显差异。在PsA SF中，中间体单核细胞、巨噬细胞、cDC1、cDC2、CD206+cDC2、pDC、记忆CD8 T细胞、记忆CD4T细胞和CD56bright NK细胞显著增加；非经典单核细胞、嗜碱性粒细胞、初始CD8 T细胞、初始 CD4 T细胞、B细胞、CD56dim CD16+NK细胞和NKT细胞则显著减少（图2）。

图1 | PsA滑液（SF）、血液的实验流程和主成分分析

图2 | PsA SF CyTOF分析细胞组群适应性

11例PsA患者中有4例服用甲氨蝶呤，对单核细胞或巨噬细胞没有影响，而cDc1、CD206+cDC2及CD56dim CD16+NK细胞增加，激活的记忆性CD8 T细胞减少。与血液相比，甲氨蝶呤并不影响PsA SF的总体升高/降低。将健康血液与PsA血液进行比较，发现PsA血液中pDC和MAIT细胞的频率降低(补充图S1)。

2. PsA SF中扩展多个记忆T细胞亚群

与血液相比，PsA SF中PD1hi记忆CD4 T细胞，PD1mid记忆CD4 T细胞、CD25hi记忆CD4 T细胞、CD49a+记忆CD8 T细胞群显著增加，并采用FlowSOM对细胞群聚类分析（补充图S2）。

3. PsA SF髓样细胞在体外孵育时自发释放促炎蛋白

体外孵育SF和PsA患者的血液，并将匹配的样品进行比较。除了18种细胞表面谱系标记物，还包括18种细胞内标记物以检测细胞因子、趋化因子和其他分泌蛋白，包括IFNg、IL-4、IL-10、IL-17和IL-21（主要由T细胞分泌）以及IL-8、CCL2、CXCL10、骨激活素和骨桥蛋白（主要为髓样细胞）。采用FlowSOM对细胞群进行聚类分析，在经典单核细胞、中间单核细胞和巨噬细胞的SF中，骨桥蛋白、CCL2和IL-8在T6时均显著增加。PsA血液中，由于中间单核细胞太少，无法分析单核细胞（图3A、补充图S3A-3B、S6和补充表S3）。

PsA SF中的 CD11c+CD14 + CD123- 细胞在6小时内产生了骨桥蛋白、CCL2和IL-8。但在血液中仅检测到少量骨桥蛋白，SF单核细胞中CCL2和IL-8显著高于血单核细胞（图3C-D），SF单核细胞中产生较高的CXCL10和骨化素（补充图S7）。T细胞因子在6小时期间释放的信息发现，SF MAIT细胞中IL-10的表达增加了95%（补充图S5）。选用PMA /离子型霉素作为阳性对照，显示了T细胞的召回能力和产生细胞因子的能力（补充图S8）。

图3 | PsA SF单核细胞/巨噬细胞在离体6小时内自发产生骨桥蛋白、CCL2和IL-8（CXCL8）

4. 与匹配的PBMCs相比，SPP1和CCL2在SF T细胞和单核细胞的基因表达中均上调

从匹配的PBMC和SF样本中提取CD14 +细胞、记忆CD8 T细胞和记忆CD4 T细胞，三种细胞类型与血液相比，发现SF失调的基因表达上调（图4B）。在SF CD14 +细胞中，骨桥蛋白基因SPP1是上调最高的基因。CD14+细胞中CCL2和CXCL10同时上调，但CXCL8 （IL-8基因）未上调。CyTOF数据集中，尽管OLR1和TNF显著上调，但相应的蛋白没有显著增加（图4C）。

PsA PBMCs中的基因表达与对照样本比对（补充图S9A）。SPP1和CCL2仅在PsA SF与PsA血中上调，而在PsA血中和健康血中无显著差异。与健康血液相比，PsA SF中CXCL10 IL上调，但在PsA血中下调（补充图S9B）。与血浆相比，SF中骨桥蛋白、CCL2和IL-8均富集（图4D）。对血液和SF的单核/巨噬细胞簇，进行差异基因表达分析，发现SPP1上调最多。SF中的SPP1和CCL2均在多个细胞群中表达，但表达水平相对较低。CyTOF数据中，SF的单核/巨噬细胞群体的细胞因子、趋化因子基因上调最高（图5）。

图4 | 分析PsA SF CD14+细胞、记忆CD8+T细胞和记忆CD4+T细胞基因

图5 | PsA SFMC的scRNA测序数据中，单核细胞/巨噬细胞中骨桥蛋白和CCL2基因高度上调

相关讨论

通过基因水平证实，在新分类的PsA SF CD14单核细胞/巨噬细胞和scRNAseq数据集中的单核细胞/巨噬细胞的SPP1（骨桥蛋白的基因）上调最高。SF T细胞中，CyTOF没有检测到骨桥蛋白，而骨桥SF CD4 T细胞中也没有CXCL13。PsA单核细胞/巨噬细胞产生了IL-8（CXCL8），但血液中的含量高于SF，说明滑膜组织细胞或中性粒细胞可能是PsA的主要来源。

研究结论

通过质谱流式细胞术（CyTOF）结合转录组学分析技术，发现在没有任何体外刺激的情况下，经典单核细胞、中间单核细胞和巨噬细胞会自发产生大量的促炎介质骨桥蛋白和CCL2。基因表达分析PsA 单核细胞/巨噬细胞，发现基因显著上调的骨桥蛋白和CCL2，且这两种蛋白质在PsA SF中也显著升高。生成的PsA SF和血液的综合细胞图谱，揭示了PsA 中具有潜在致病性和治疗重要性的关键骨髓促炎模块。

小鹿推荐

质谱流式细胞术结合组学分析技术揭示了银屑病关节炎滑液中的骨髓促炎特征，生成的PsA SF、血液白细胞高维数据图谱，体外识别了淋巴和骨髓细胞因子。研究分析，单核细胞/巨噬细胞的抑制疗法，是引发PsA炎症的因素之一；骨桥蛋白和CCL2两种蛋白对PsA诊断和治疗有一定作用。

参考文献

1.Veale DJ, FearonU. The pathogenesis of psoriatic arthritis. Lancet 2018;391(10136):2273-84. doi: 10.1016/S0140-6736(18)30830-4[published Online First: 2018/06/13]

2. MeasePJ, GoffeBS,Metz J, et al. Etanerceptin the treatment of psoriatic arthritisandpsoriasis: a randomized trial.Lancet 2000;356(9227):385-90.doi:10.1016/S0140-6736(00)02530-7[published Online First:2000/09/06]

3.McInnes IB,Kavanaugh A,Gottlieb AB, et al.Efficacy and safety ofustekinumabin patients with active psoriatic arthritis:1 year resultsof the phase 3,multicentre,double-blind,placebo-controlled PSUMMIT 1 trial. Lancet 2013;382(9894):780-9. doi:10.1016/S0140-6736(13)60594-2[published Online First:2013/06/19]

4.MeasePJ, McInnes IB, KirkhamB, et al. Secukinumab Inhibition of Interleukin-17A in Patients with Psoriatic Arthritis. NEngl J Med 2015;373(14):1329-39. doi:10.1056/NEJMoa1412679[published Online First:2015/10/01]

5.Steel KJA, Srenathan U, Ridley M, etal. Polyfunctional,Proinflammatory, Tissue-Resident Memory Phenotype and Function of Synovial Interleukin-17A+CD8+T Cells in PsoriaticArthritis. Arthritis Rheumatol 2020;72(3):435-47.doi:10.1002/art.41156[published Online First:2019/11/05]

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END

小妮子|撰文

小久|排版

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