初试锋芒| 运用PRM（WB替代技术)&TMT蛋白标记定量技术对植物病原菌抗逆性研究

2019年12月，四川农业大学林学院课题组发表题为“Differential Proteome Analysis of Hybrid Bamboo (Bambusa pervariabilis × Dendrocalamopsis grandis) Under Fungal Stress (Arthrinium phaeospermum)”的研究论文，该研究报道了在真菌胁迫下，杂种竹生长过程中，与自身抗性相关的蛋白表达受到显著影响。本文作者运用TMT标记定量蛋白组学及PRM蛋白验证技术通过对杂交竹在真菌胁迫过程中蛋白变化网络的分析，探讨真菌胁迫条件下杂交竹的差异表达蛋白和信号通路。

iTRAQ 和TMT 标记技术是定量分析差异蛋白质组学的主要技术，特别是TMT标记定量蛋白质组学技术已经成为一个热点。平行反应监测(PRM)技术是当前靶向蛋白质组学研究的重要手段。最近,这种技术结合iTRAQ或TMT广泛应用于医药和环境工业的蛋白质组中，但在植物领域，特别是植物与病原菌相互作用方面的研究较少。

杂交竹种因其独特的生长繁殖能力而在我国南方广泛种植。然而，杂交竹枯萎病是一种破坏性病害，研究发现毛竹基腐病菌通过分生孢子感染竹子。现已完成了对病原菌胁迫的代谢组学应答。然而，对病原菌的蛋白组学研究仍然未知。

采用TMT蛋白定量分析技术，对接种病原菌和无菌水的杂交竹进行蛋白质的差异表达研究。然后，采用PRM靶向蛋白组技术进行了定量表征在差异表达蛋白中具有重要生物学功能的靶蛋白。该研究有助于植物抗病关键蛋白的鉴定，为制定新的病害防治策略提供依据。

1. 实验分组

①15株一年生杂交竹，采用针刺法，对每株的8个嫩枝注射50μl毛竹基腐病菌，并套袋保湿12个小时，连续三天重复接种。当竹子出现枯萎病症时，采取注射毛竹基腐病菌杂交竹的嫩枝，组成三个生物学重复，并保存在-80℃中（实验组）。

②15株一年生杂交竹，采用针刺法，对每株的8个嫩枝注射50μl无菌水，并套袋保湿12个小时，连续三天重复接种。当注射毛竹基腐病菌的竹子出现枯萎病症时，采取注射无菌水杂交竹的嫩枝，组成三个生物学重复，并保存在-80℃中（对照组）

2. 检测方法

①分别提取实验组和对照组的蛋白，经过酶解、TMT试剂标记。

②多组份分离后，高分辨质谱QE-plus进行定性、定量，筛选显著差异蛋白。

③PRM验证候选标志物。

通过质谱检测分析后共鉴定出3320个unique peptide，鉴定到1791个蛋白，当倍数变化超过1.2倍且p value < 0.05时，即认为是差异表达蛋白。因此共筛选出102个显著差异蛋白，66个蛋白上调、36个蛋白下调。上调的蛋白大多数属于奇异果甜蛋白家族，ID PH01000846G0450且差异倍数为5.480。下调蛋白大多数是叶绿素A-B结合蛋白， ID PH01000947G0680 且差异倍数为0.398。

表1 |蛋白鉴定结果统计

通过生物学过程、分子功能和细胞成分三方面分析两种处理条件下鉴定到的杂交竹蛋白的GO功能，结果显示在细胞结构方面蛋白质富集的功能项为叶绿体、质体部分、叶绿体基质（胞质72个差异表达蛋白，胞内细胞器71个差异表达蛋白）。在分子功能方面蛋白质富集的功能项有氧化还原酶活性、 四吡咯结合、辅因子结合以及血红素结合（33个显著差异表达蛋白）。在生物学过程方面，单个有机体生物合成过程的蛋白富集（31个显著差异表达蛋白）。

图1 | 差异蛋白的BP、CC、MF富集结果

KEGG富集分析显示差异蛋白主要集中在代谢途径：

图2 | KEGG富集结果

其中显著富集差异表达蛋白的代谢途径为代谢途径(map01100)(34个差异表达蛋白)；次级代谢物的生物合成(24个差异表达蛋白)；微生物在不同环境中的代谢(map01120)(14个差异表达前蛋白)；碳代谢(map01200)(13个差异表达蛋白)；氨基酸的生物合成(map01230)(11个差异表达蛋白)。

图3 | 基于GO和KEGG分析的信号通路对蛋白质的响应

图4 | P值最高的前10条KEGG信号通路

使用Cytoscape软件绘制PPI分析图，基于基因-相互作用网络，该网络将蛋白质-蛋白质相互作用结果与其他证明如差异倍数、KEGG富集和生物过程富集结合在一起。

图5 | 代谢通路

其中,D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶,催化域(ID: PH01000290G0470) ,转醛醇酶(ID: PH01005665G0070)Indole-3-glycerol磷酸合成酶(ID: PH01005469G0070)和谷氨酰胺酰胺转移酶class-I,肽酶C26(ID: PH01000041G1710)是上调的,并通过处理组与对照组之间的蛋白/基因相互作用参与几个显著富集代谢途径。

表2 |PPI中的参与显著富集代谢途径高相关性的差异蛋白信息

为了验证TMT标记定量的准确性，利用PRM分析11个靶蛋白的候选肽(这11个肽是每个蛋白的unique peptide)。PRM定量结果显示11个候选蛋白中有10个与TMT趋势相似，PRM验证与TMT数据的趋势一致性为91%，说明TMT获得的数据是可靠的。

表3 |11个候选蛋白的PRM和TMT定量信息表

病原菌毛竹基腐病菌侵染的杂交竹的差异蛋白在次生代谢物的合成上显著富集。其中，被毛竹基腐病菌侵染的杂交竹的上调蛋白中的肉桂醇脱氢酶在植物木质素合成中起着关键作用。它能提供必要的强度、疏水性和对外界病原菌的抗性。此外还有，蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的上调导致植物组织细胞在胁迫下程序性死亡，以抵抗病原菌感染。由此推测，接种致病真菌毛竹基腐病菌的杂交竹在氧化还原、次生代谢产物合成和氨基酸合成等过程中，其差异蛋白显著富集，且存在与杂交竹抗病性相关的蛋白。

本文首次将PRM蛋白验证（WB替代技术）技术与TMT蛋白标记定量技术结合并应用于植物与病原菌相互作用方面，研究了真菌毛竹基腐病菌胁迫下杂交竹代谢过程中蛋白的变化，并筛选出与杂交竹抗病性相关的显著差异蛋白且对其进行了验证，为竹的抗逆性研究提供了理论依据，值得推荐。

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