【前沿组学】基于 LC-QTOF MS 酸性鞘糖脂全面表征的新策略—助力神经系统疾病生物标记物的有效发现

2018-11-10 11:01:17, 安捷伦 TSA 团队安捷伦科技（中国）有限公司

作者：胡婷博士研究生，张金兰研究员（中医科学院药物研究所）

冉小蓉博士（安捷伦科技）

本期分享内容来自中国医学科学院药物研究所张金兰研究员课题组最新发表在 Analytical Chemistry 上的题为 Strategy for Comprehensive Profiling and Identification of Acidic Glycosphingolipids Using Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry的文章。

文章链接：http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.7b02023

酸性鞘糖脂（Acidic glycosphingolipids, AGSLs）主要包括神经节苷脂类和硫苷脂类化合物（代表结构如图 1 所示），其中，神经节苷脂是迄今为止发现的结构最复杂、种类最繁多的一类脂质分子。AGSLs 是细胞脂膜的重要组分，主要分布在中枢神经系统中，其与脑组织的发育关系紧密，神经系统病变疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症和脑缺血等均被报道与 AGSLs 密切相关。临床上有神经节苷脂钠注射液（单唾液酸四己糖神经节苷脂），用于治疗血管性或外伤性中枢神经系统损伤和帕金森氏病。

图 1.神经节苷脂（A）和硫苷脂（B）代表性化学结构

由于 AGSLs 结构的复杂和多样性，基于 LC-MS 的鉴别和定量依然存在诸多的瓶颈问题：

对照品的缺乏；
同分异构体难以色谱分离；
低分辨质谱上同位素峰干扰准确定量；
通常使用的负离子模式 CID 裂解，无法得到神经节苷脂鞘氨醇链结构相关的碎片离子，结构难以鉴别。

本研究针对上述瓶颈问题，探索了基于 UHPLC-QTOF MS 的酸性鞘糖脂全面分析和识别的新策略。

UHPLC-QTOF MS 方法开发及优化

采用安捷伦 1290 UHPLC-6550 QTOF MS 建立了 AGSLs 的分离及鉴定方法，首次实现了在反相色谱柱（C8 和 C18 柱）上对含有不同糖链的神经节苷脂同分异构体的分离（图 2）。与之前文献报道流动相只采用甲酸铵或乙酸铵不同，本方法经过优化之后，在流动相中添加了适量甲酸，可以抑制弱酸性神经节苷脂分子在流动相中的解离，增强了其在反相色谱柱上的保留，并且能起到改善峰形、增加理论塔板数的作用，进而显著提升分离效率。

图 2. Agilent C18 柱（A）和 C8 柱（B）上 GD1a/b 的提取离子流图，黑色表示只加入甲酸铵的流动相条件下的提取离子流图；红色表示同时加入甲酸铵和甲酸的流动相条件下的提取离子流图。

由于 AGSLs 缺乏单一对照品，本研究首先采用商品化混合对照品分析和鉴别已知结构的 AGSLs 化合物。采用正离子模式，获取化合物一级和二级高分辨质谱数据，基于质谱数据和保留时间全面解析 AGSLs 化合物的寡糖、脂肪酸链和鞘脂链的结构信息，最终在混合对照品中鉴别了 304 种 AGSLs 化合物。

结合数学模型建立生物样本 AGSLs 全面表征的新策略

通过深入分析在混合对照品中鉴定的 304 种 AGSLs 化合物，发现具有相同不饱和度的 AGSLs 化合物的神经酰胺碳原子数与其保留时间存在良好的对数关系，以此建立数学模型实现对理论存在 AGSLs 化合物保留时间进行预测。结合该数学模型进一步开发了生物样本中 AGSLs 快速识别的新策略（流程如图 3 所示）。

图 3.生物样本中 AGSLs 快速识别和鉴定的新策略

新策略主要工作流程如下：

为每一类 AGSLs 化合物指定一个参照化合物（混合对照品中鉴定的高丰度该类化合物，并在拟分析的生物样本中存在），用于相对保留时间 RRT 的计算；
将参比化合物的保留时间代入数学模型中，获取所有理论存在的 AGSLs 的保留时间预测值 pRT；
建立理论 AGSLs 化合物的数据库，包含神经酰胺碳原子数、预测保留时间 pRT 和精确一级准分子离子 m/z 值；
本研究建立了包含 571 个 AGSLs 化合物信息的数据库，覆盖 304 个混合对照品中鉴定的化合物和 267 个由数学模型预测理论存在的化合物；
生物样本进行 UHPLC-QTOF MS 分析，获得保留时间和一级准分子离子 m/z，检索理论 AGSLs 化合物的数据库，鉴定生物样本中存在的 AGSLs 化合物。

与常用的保留时间预测策略 QSRR（Quantitative Structure-Retention Relationship，定量结构-保留时间相关性）进行对比，本研究所建立的新策略具有更高的保留时间预测准确性，并且，模型建立更简单容易，可直接在 Microsoft Excel 中完成，而不需要特别使用额外的软件。

新策略用于双侧颈总动脉结扎所致的脑缺血模型大鼠与对照组大鼠脑组织样本 AGSLs 轮廓分析

基于上述新策略，表征了双侧颈总动脉结扎所致的脑缺血模型大鼠与对照组大鼠脑组织样本 AGSLs 轮廓，并在大鼠脑组织生物样本中共鉴定和定量了 199 个 AGSLs 类化合物。经过进一步统计学分析，发现模型组与对照组大鼠脑组织比较，显著差异的 AGSLs 类化合物主要为 GD1a，GD1b，GM1，GM3， GQ1b，GT1b 和硫苷类化合物。

图 4. 2-VO 模型大鼠与对照组大鼠 AGSLs 差异代谢物分析

本研究建立了基于 UHPLC-QTOF MS 酸性鞘糖脂全面分析和识别新策略，该策略首次实现了具有不同糖链结构的 AGSLs 同分异构体的分离，巧妙结合数学模型建立了包含 571 种 AGSLs 化合物的理论高分辨一级质谱数据、结构和保留时间信息的数据库，并成功用于脑组织生物样本中 AGSLs 的快速全面表征及差异代谢物的寻找。本研究建立的策略对于 AGSLs 重要生理学功能的阐明及其在神经系统疾病中潜在诊断和药用价值的开发具有非常重要的意义。

参考文献：

Hu, T., Jia, Z., Zhang, J. L.,Strategy for Comprehensive Profiling and Identification of Acidic Glycosphingolipids Using Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry, Anal Chem 2017, 89, 7808-7816.

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