【前沿组学】非靶向旨在兼收并蓄，如何能够去伪存真？

非靶向代谢组学旨在全面检测生物样本中所有内源性小分子代谢产物，然而，数以千计的谱峰响应，有多少是真正生物来源的信号？其中又有多少具有良好的定量性能？如果这些问题不回答，最终发现的生物标志物的有效性将受到质疑。本期分享内容将针对非靶向代谢组学数据，去伪存真，助力生物标记物的有效筛选。

分享内容来自中国科学院植物研究所漆小泉研究员课题组段礼新博士在 Molecular Plant  上发表的题为 Discrimination and Quantification of True Biological Signals in Metabolomics Analysis Based on Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 的文章。

文章链接：http://klpmp.net/admin/Upload/2016621151840362.pdf

随着高灵敏度、高分辨率色谱质谱分析仪器的迅速发展，非靶向代谢组学已可很容易实现数千种小分子代谢物的同时检测。但与此同时，也会不可避免地产生大量假阳性信号，诸如来自溶剂、系统背景及样品制备过程等的干扰，可以统称为非生物来源信号。即使对于生物来源的质谱信号，它们的峰面积是否与代谢物浓度之间存在较好的定量关系？是否能筛选为后续靶向验证的目标化合物？在缺少有效的数据评价方法下，往往不容易筛选出真实的生物标记物，或者筛选到假阳性生物标志物。

研究基于 UHPLC-QTOF MS 非靶向质谱数据, 解决从复杂谱峰中区分生物来源和非生物来源信号，并进一步筛选出具有良好定量性能的谱峰，实现精确的相对定量，最终助力生物标记物的有效筛选。

策略流程图

图1. 策略流程图

QC 样品制备：混合所有生物样本制备质控样本（QC）作为代谢物混合池（pool），并逐级稀释。

UHPLC-QTOF MS 数据采集：对空白样品、QC 及 QC 系列稀释样本进行 Full-scan 重复性检测，实际生物样本随机排列采集数据。

五步峰过滤规则筛选生物来源峰：基于空白样品、QC 及 QC 系列稀释样本的重复性数据，采用五步峰过滤规则（重复性过滤、标准偏差过滤、空白对照过滤、定量相关系数过滤、手动过滤）对 QC 质谱峰过滤，同时评价每一个峰的定量能力（Quantitative performance）。最终筛选出稳定性、定量性好的生物来源质谱峰列表。

相对浓度指数建立定量校正模型：结合 QC 梯度稀释曲线，同时引入相对浓度指数（Relativeconcentration index, RCI），建立所有有效质谱峰的定量校正模型。该方法通过编写 Python 脚本，自动化将数百个过滤后的峰进行最优化回归分析，建立最优化的定量校正模型，包括模型类型（线性、二项式、指数、对数）、决定系数、模型适应的相对范围等。该模型不仅可以用于定量校正，而且可以将质谱峰面积归一化到 RCI，使用 RCI 而不是峰面积进行组间比较，使得相对定量结果更精确。

图2. 回归模型和相对浓度指数（A：线性模型；B：对数模型；C：二项式模型；D：组合模型。图A显示了利用峰面积计算RCI的示例，DS：稀释系列）

新策略用于水稻代谢组学研究及优势

基于安捷伦 1290 UHPLC - 6540 QTOF MS 数据采集，采用标准品添加的人工样品评估该了策略的适用性，进一步对两种典型的水稻品种籽粒 9311（Oryza sativa L. ssp. indica）和 Nipponbare （O. sativa L. ssp. japonica）进行了代谢组学分析。结果表明，该方法可有效过滤水稻籽粒提取样本中 71.4% 的非生物来源及定量性能差的质谱峰信号；与传统非靶向代谢组学结果比较，本方案的流程可大大提高主成分分析模型的解释能力和预测能力（图 3 和图 4）。利用本研究流程，最终有效筛选出了 30 种包括脂质、黄酮、氨基酸等差异内源性小分子，用于区分两种水稻籽粒。 

图3. 新方法与传统方法在 PCA 得分图差别，左为传统方法，右为采用 RCI 的新方法

图4. 新方法与传统方法在 PCA 模型建立中的差别，左为传统方法，右为新方法，白色直方图为主成分模型的解释百分比，黑色直方图是主成分模型的预测能力

本研究基于高分辨非靶向代谢组学数据，提出五步峰过滤规则和 RCI 相对浓度指数，实现了有效区分复杂谱图中生物来源和非生物来源的质谱信号，同时评价每一个峰的定量能力，最终筛选出稳定性、定量性好的生物来源的质谱峰进行精确的相对定量分析，极大的提高了生物标志物筛选的有效性。本研究同时为非靶向到拟靶向代谢组学的拓展提供了很好的启示。

参考文献：

Duan Lixin, István Molnár, John Hugh Snyder, Guo An-shen, Qi Xiaoquan. Discrimination and quantification of true biologicalsignals in LC-MS-based metabolomics analysis. Molecular Plant, 2016,9(8): 1217-1220.

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